1、胎兒頭皮毛囊內(nèi)黑素細(xì)胞 HMB-45和NKIbeteb的表達(dá)Location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp LI Hong-zhou,XUE Dong-zhang,ZHANG Ru-zhi,ZHU Wen-yuan,ZHANG Jing,CHEN Ze-nong,ZHAO Hao(1. Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Hefei 233004,Anhui,China):ObjectiveTo expl

2、ore the location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp. MethodsThe scalp was from a died fetus (fetal age of 7 months, induction delivery due to developmental abnormity ) and prepared for frozen sections, thenwhich respectively received immunofluorescent and immunofluochemical staining with

3、 HMB-45 and NKI/beteb antibodies. The stain results was observed and photographed by confocal microscope and the inverted microscope, respectively. ResultsThe positive cells stained by NKI/beteb antibody were mainly located at the bulge regions in the outer root sheath (ORS) of hair follicle, some i

4、n the hair bulbs and the epidermal basilar parts. The HMB-45 positive cells were present in the hair bulb, the hair matrix and the epidermal basilar parts, but not in ORS.ConclusionThere are melanocytes with different status in hair follicle. Melanocyte at the bulges of ORS is melanoblast.毛囊是一個獨特的皮膚

5、附屬器 , 其色素單位的自我更新取 決于毛囊內(nèi)的黑素干細(xì)胞 (melanocyte stem cells, MSCs) 及其 子代細(xì)胞。毛囊MSC特征如下:具備不成熟、慢循環(huán)、自我修復(fù)、 產(chǎn)生子代細(xì)胞 , 并且活化增殖毛發(fā)生長早期的細(xì)胞。毛囊黑素干 細(xì)胞(follicle melanocyte stem cells,FMSC)是 MSCS中的一種。有報道鼠毛囊外隆突區(qū)檢測出MSCs1。鼠的胚胎研究顯示,FMSC存在于毛囊永久性區(qū)域的下部毛囊隆突區(qū)，具有MSCS的特征,受刺激后可以分化成為成熟的黑色素細(xì)胞 2 。因此, 筆者 設(shè)計此實驗初步定位人胎兒的FMC觀察HMB45,NKI/beteb在人

6、類胎兒毛囊中的表達(dá)情況。材料和方法材料標(biāo)本來源 : 引產(chǎn)胎兒的頭皮 (胎齡 7月, 畸形引產(chǎn) ), 取 標(biāo)本時 , 胎兒已死亡 2h。1.1.2主要儀器及試劑：小鼠抗人HMB-45單克隆抗體(北京 中山生物技術(shù)公司 ); 小鼠抗人 NKI/beteb 單克隆抗體 (Abcam);DyLightTM488 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG( 北京中山生物技術(shù) 公司)辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(北京中山生物技術(shù)公 司);0LYPUS倒置顯微鏡；激光共聚焦顯微鏡(NIKON-EZ-C1SI)。1.2 方法1.2.1標(biāo)本處理:獲取胎兒頭皮，用碘伏浸洗5min后,酒精 去碘伏 , 接著生理鹽水沖洗數(shù)次 , 剪刀修

7、剪組織標(biāo)本 , 去除脂肪 , 筋膜等多余組織 , 再用生理鹽水沖洗數(shù)次 , 最后多聚甲醛固定組 織15min后，制備冰凍切片(4卩m),用冷丙酮固定15min。共聚焦顯微鏡觀察 :TBS+0.025%triton-100 溶液浸 洗組織切片 ,5min/ 次, 需 2次,5%牛血清白蛋白室溫封閉 15min。 TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片 ,5min/ 次,需2次。分別 加入一抗小鼠抗人 HMB-45(1:100),NKI/beteb(1:100) 單克隆抗 體孵育,4 C過夜。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片3 次,5min/次。暗室內(nèi)加免

8、疫熒光二抗 DyLightTM488標(biāo)記山羊抗 小鼠lgG(1:200),37 C孵育,2h。TBS溶液浸洗組織片3次,5min/ 次。自然晾干。 90%甘油封片。 DyLightTM488-TFP 熒光素是在 Omnichrome氬-氟離子激光器的488nm處激發(fā),515565nm波段 處濾過發(fā)射。激光共聚焦顯微鏡下觀察攝片。1.2.3倒置顯微鏡觀察:PBS洗浸洗組織切片,0.3% Trito nX-100孵育,PBS洗,5%牛血清白蛋白封閉10min,分別加入一抗 小鼠抗人 HMB-45(1:100),NKl/beteb(1:100) 單克隆抗體孵育 2ho PBS洗,加免疫組化二抗辣根酶

9、標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育30min。PBS洗,SP反應(yīng),DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯 透明,中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察攝片。結(jié)果2.1 激光共聚焦顯微鏡 : 激光共聚焦顯微鏡觀察 NKI/beteb 抗體免疫熒光標(biāo)記顯示 , 毛球部熒光強度高 , 呈簇集狀 , 沿毛球線 形分布（圖1A）。在毛囊的橫斷面或斜切面上，熒光在毛囊周圍及 其附近皮脂腺結(jié)構(gòu)處明顯 , 呈線狀勾勒出毛囊的切面的輪廓 , 在 表皮基底部 , 熒光呈點線狀分布 （ 圖 1B） 。在毛外根鞘中下段可以 清楚的看到，均勻分布的熒光染色，放大后可見12個細(xì)胞聚集 在一起（圖1C）。HMB-45抗體免疫熒光標(biāo)記顯示，

10、在毛囊的縱切面 上, 熒光在毛漏斗部和毛球部處明顯 , 呈線狀勾勒出毛球的切面 的輪廓；熒光在表皮基底均勻分布（圖1D）。在毛囊的橫切面上， 熒光在毛囊周圍，皮脂腺周圍增強（圖1E）。根據(jù)外形推測這兩個 毛囊 , 為休止期毛囊。 其熒光最顯著處 , 推測是毛球底部、 毛乳頭 區(qū)（圖1F）。但是，熒光在毛囊外根鞘出沒有分布，這表明外根鞘 細(xì)胞HMB-45表達(dá)陰性。綜合以上觀察 , 在胎兒頭皮中 NKI/beteb 陽性細(xì)胞大多分布于毛囊毛球部 , 毛漏斗部 , 皮脂腺 , 表皮基底部 和毛囊外根鞘中下段。HMB-45陽性的細(xì)胞大部分位于毛囊毛囊 漏斗部,毛球部,皮脂腺和表皮基底部 ,而毛囊外根鞘

11、上的細(xì)胞表 達(dá)HMB-45呈陰性。倒置顯微鏡觀察 : 倒置顯微鏡觀察 NKI/beteb 染色, 顯 示毛囊的斜切面 ,NKI/beteb 染色陽性的棕色顆粒 , 分布在毛球部 及外根鞘中下部部位（圖2A）。在毛漏斗部及其周圍的皮脂腺也 有陽性細(xì)胞分布 （圖 2B）, 進一步放大倍數(shù)可以看到 ,在毛球部聚 集陽性細(xì)胞。這些陽性細(xì)胞 23個聚集，體積比較小，無明顯樹 突, 形態(tài)與其周邊的細(xì)胞相類似 , 但是其周邊細(xì)胞中無陽性顆粒 （圖2C）。HMB-45染色,顯示陽性細(xì)胞位于毛母質(zhì)（圖2D）,毛囊毛 球部有陽性細(xì)胞分布 , 呈棕褐色顆粒 , 簇集狀分布 （圖 2E）; 皮膚基 底部也散在分布陽性

12、細(xì)胞 , 呈點狀線性分布 （圖 2F）。綜合以上觀察 ,NKI/beteb 抗體染色顯示 , 陽性細(xì)胞分布在毛 球 , 毛漏斗部及外根鞘 , 在外根鞘的中下段 , 有少數(shù)成群分布的被 染成褐色的細(xì)胞，胞體較扁圓，無明顯樹突。HMB-45抗體染色顯 示, 在外毛根鞘上細(xì)胞均呈陰性 , 而在毛母質(zhì)區(qū)和毛球部為陽性。討論人黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴 , 在胚胎發(fā)育早期 （25周）逐步向 毛囊、表皮等處移行。在其移行過程中 , 有少數(shù)成黑素細(xì)胞在中 途停滯或者開始轉(zhuǎn)化成為無黑素合成活性并且未活化的黑素細(xì) 胞（Amela notic Mela no cyte, AMMC）。早在 1954 年,Chase 提出

13、 在毛囊上外跟鞘部存在一群細(xì)胞 , 它們不僅能夠再生毛囊 , 還可 以再生皮脂腺和濾泡間上皮。 在每個毛囊周期期間這些細(xì)胞導(dǎo)致 毛囊皮脂腺單位的重塑。 現(xiàn)在已知這種重塑由存在于毛囊內(nèi)的干 細(xì)胞系控制。在人類毛囊中已經(jīng)鑒定出幾種類型的干細(xì)胞 , 包括 表皮干細(xì)胞、 間充質(zhì)樣干細(xì)胞 3-4 、黑素細(xì)胞干細(xì)胞 5 和巢蛋 白陽性干細(xì)胞 6-7 。已經(jīng)證實這些細(xì)胞在毛囊中既存在于不同 微環(huán)境, 又交錯在一起。鼠黑素母細(xì)胞的分化增殖條件已被廣泛 研究, 研究者們認(rèn)為毛囊和皮膚的黑素細(xì)胞干細(xì)胞來源于這些細(xì)胞 8-9 。在毛囊外毛根鞘處可以分離和培養(yǎng)出AMMC10。 在國內(nèi)外把從毛囊中分離和培養(yǎng)出的黑素細(xì)胞

14、稱黑素母細(xì)胞 11 。盡 管在鼠和人胚胎皮膚中確定并容易鑒定隆突 , 但是在成人毛囊中 隆突并沒有形態(tài)學(xué)外觀 12 。所以人們?nèi)找鎸β⊥桓杉?xì)胞特異性 標(biāo)志物感興趣。AMC中的黑素小體發(fā)育不成熟，但在基因調(diào)控或外界刺激下 激活，增殖，且具有黑素化能力。NKI/beteb和HMB-45單克隆抗 體都識別黑素小體上的膜分子蛋白 -gp100, 前者識別前黑素小體 和成熟的黑素小體上的 gp100, 但后者只識別成熟的黑素小體上 的gplOO。這可能是由于這兩種抗體識別同一個分子不同的表位。 所以,HMB-45單克隆抗體都不能單獨標(biāo)記出這類黑素細(xì)胞。然而 可以借助NKI/beteb單克隆抗體等抗體的聯(lián)合來識別 AMMC本次試驗發(fā)現(xiàn) ,NKI/beteb 陽性細(xì)胞是位于外毛根鞘中下段 , 毛球部，毛漏斗部及其皮脂腺。但在 HMB-45染色中，陽性細(xì)胞在 毛母質(zhì)，毛球部。外根鞘中沒有HMB-45陽性細(xì)胞。因此筆者推測 外毛根NKI/beteb陽性染色的細(xì)胞就是AMMC它們僅表達(dá)前黑素 小