1、2015離心技術(shù)的應(yīng)用梁舒瑤 萬琪 尹雅杰 王明瑞目錄CONTENTS1離心技術(shù)的原理2發(fā)展歷史3常用的離心技術(shù)4Q & A離心技術(shù)的原理PARTONE離心力Centrifugal Force只要知道離心機的rpm 和顆粒到轉(zhuǎn)軸的垂直距離，就可以計算顆粒所受的離心力超速離心：g低速離心：rpm離心技術(shù)的原理離心力沉降系數(shù)Sedimentation Coefficient離心技術(shù)的原理沉降系數(shù)離心技術(shù)發(fā)展歷史PARTTWO1864Antonin Pranaltl 發(fā)明了簡易離心器，用于分離奶酪1879瑞典工程師古斯塔法發(fā)明了真正的離心機，容量130L，轉(zhuǎn)速5000rpm1911低速（3000rp

2、m）臺式離心機用于商業(yè)化生產(chǎn)1923斯威德伯格發(fā)明超速離心機，開創(chuàng)生化物質(zhì)分離的先河1929瑞典科學(xué)家 Ole Albert Lamm 推導(dǎo)出沉降方程，定義沉降系數(shù)1930離心技術(shù)經(jīng)不斷的改進(jìn)，逐漸發(fā)展出差速分離技術(shù)、速率-區(qū)帶密度離心法、等密度離心法等離心方法離心技術(shù)的歷史 常速離心機又稱為低速離心機。其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104g以下，主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基殘渣等固形物，和粗結(jié)晶等較大顆粒。常速離心機的分離形式、操作方式和結(jié)構(gòu)特點多種多樣，可根據(jù)需要選擇使用。 1常速離心機 高速離心機的轉(zhuǎn)速為11042.5104r/min。相對離心力達(dá)1

3、1041105g，主要用于分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器等。為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活，有些高速離心機裝設(shè)了冷凍裝置，稱高速冷凍離心機。2高速離心機 超速離心機的轉(zhuǎn)速達(dá)2.51048104r/min，最大相對離心力達(dá)5105g甚至更高一些。超速離心機的精密度相當(dāng)高。為了防止樣品液濺出，一般附有離心管帽；為防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)。此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動系統(tǒng)及各種指示儀表等。 3超速離心機分析用超速離心機用于樣品純度檢測時，是在一定的轉(zhuǎn)速下離心一段時間以后，用光學(xué)儀器測出各種顆粒在離心管中的分布

4、情況，通過紫外吸收率或折光率等判斷其純度。若只有一個吸收峰或只顯示一個折光率改變，表明樣品中只含一種組分，樣品純度很高。若有雜質(zhì)存在，則顯示含有兩種或多種組分的圖譜常用離心技術(shù)PARTTHREE01020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)01020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)常用離心技術(shù)沉淀離心法分離原理可溶性部分和不溶性顆粒的分離顆粒形成沉淀，與上清液分離離心速度固定轉(zhuǎn)速分離效率離心機轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)子半徑離心時間應(yīng)用范圍用于乳濁液、懸濁液除去溶液中懸浮的雜志常用離

5、心技術(shù)應(yīng)用實例收集培養(yǎng)基中的大腸桿菌含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)大腸桿菌過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)臺式固定角轉(zhuǎn)子離心機12000rpm，1min倒出上清液，沉淀即為大腸桿菌01020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)常用離心技術(shù)差速離心法分離原理顆粒大小和密度不同沉降系數(shù)差異離心速度提高轉(zhuǎn)速或高低速交替優(yōu)點操作簡便，易分離沉淀可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子缺點需多次離心，分離效果差管底顆粒受到擠壓易變性失活產(chǎn)物狀態(tài)沉淀不均一，仍有其他成分2-3次再懸浮和再離心應(yīng)用范圍沉降系數(shù)差別越大，效果越好S值相差一個數(shù)量級以上，如組

6、織勻漿中分離細(xì)胞器常用離心技術(shù)應(yīng)用實例馬鈴薯線粒體的制備馬鈴薯塊莖200g，加入2.5倍體積的勻漿緩沖液，勻漿后用4層紗布過濾濾液4000rpm, 10min，收集上清液上清液13800g, 15min，收集沉淀用緩沖液重懸并加入終濃度15mmol/L的MgCl2，Dnase 處理，加入2倍體積緩沖液13800g，15min，收集沉淀，即為線粒體01020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)常用離心技術(shù)密度梯度離心法速度區(qū)帶離心分離原理在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡按照S值大小依次排列成帶離心速度一種轉(zhuǎn)速離心時間離心時間要

7、適宜，切忌隨意延長優(yōu)點分離效果好適用范圍廣顆粒不會被沉淀擠壓變形樣品處理量大缺點離心時間長需制備密度梯度介質(zhì)溶液對操作者技能要求高梯度介質(zhì)蔗糖甘油Ficoll應(yīng)用范圍密度有一定差異的樣品密度相差不大，重量和大小區(qū)別較大常用離心技術(shù)密度梯度離心法等密度梯度離心分離原理在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡根據(jù)顆粒浮力密度差異加以分離離心速度一種轉(zhuǎn)速離心時間以最小顆粒達(dá)到等密度點為基準(zhǔn),需要十幾個小時到幾天提高轉(zhuǎn)速可以縮短平衡時間優(yōu)點分離效果好適用范圍廣顆粒不會被沉淀擠壓變形樣品處理量大缺點離心時間長需制備密度梯度介質(zhì)溶液對操作者技能要求高梯度介質(zhì)密度梯度較陡。最大密度大于樣品最大；梯度最小小于樣

8、品最小堿金屬鹽類、蔗糖、甘油及Percoll等應(yīng)用范圍密度有一定差異的樣品分離純化核酸、病毒、蛋白復(fù)合體、亞細(xì)胞器等；分離純化細(xì)胞常用離心技術(shù)應(yīng)用實例制備雞胚原始生殖細(xì)胞取雞胚血200g離心5min，棄上清，沉淀用1mL 8%Nycodenz溶液重懸取5mL圓底離心管，分別加入1mL 12%Nycodenz溶液，1mL含雞胚血液的8%Nycodenz溶液，200L2%Nycodenz溶液，800g，離心20min取上層溶液1400L加入至800L 10%PBS-FBS中，顛倒混勻，200g，5min，棄上清，沉淀用200L 8%的Nycodenz溶液重懸取1.5mL離心管，分別加入600L 1

9、4 Nycodenz溶液，300L 10Nycodenz溶液，200L含細(xì)胞的8 Nycodenz溶液，800g，10min取上層溶液600L，加至1300L的10 FBSPBS中，200g，5min，棄上清，沉淀即為原始生殖細(xì)胞01020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)常用離心技術(shù)S-分離法分離原理沉降常數(shù)S差別密度差別應(yīng)用范圍S值和值都相近的混合顆粒病毒群、脂蛋白的混合體等操作原則相近S相遠(yuǎn)，差速沉降或S-區(qū)帶法S相近相遠(yuǎn)，區(qū)帶法本身S值范圍寬，先做區(qū)帶分離S相近相近，更換介質(zhì)，改變某一粒浮密度密度相同，可破壞某一種顆粒0

10、1020305沉淀離心法差速離心法密度梯度離心法速度區(qū)帶離心等密度梯度離心其余方法04S-分離法常用離心技術(shù)常用離心技術(shù)其他方法分析超速離心連續(xù)流離心離心淘洗或逆流離心淘洗離心技術(shù)的應(yīng)用by 王岱東 蔣康 林垸斌 楊揚 張最1.離心現(xiàn)象向心力：使質(zhì)點作曲線運動時所需的指向曲率中心的力離心現(xiàn)象：當(dāng)外力無法提供足夠大的向心力時，質(zhì)點的行為稱為離心現(xiàn)象離心技術(shù)：利用電機高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力場，根據(jù)不同物質(zhì)之間密度、形狀、大小等方面的差異，對懸浮液中混合的不同顆粒或乳濁液中密度不同且互不相溶的液體進(jìn)行分離和提取的技術(shù)。其中使用到的儀器稱為離心機。1.離心技術(shù)按目的：按轉(zhuǎn)速：低速3500高速（3500,5

11、0 000超速50000RCF=mr/mg=(2rps) r/gStokes定律：V=d2（-0）g/182. 分析型超速離心化合物吸附薄層色譜吸附柱層析通透層析氣-液色譜離子交換色譜電泳超速離心氨基酸+-+-多肽+-+-+-蛋白質(zhì)-+-+嘌呤/嘧啶+-+-核酸+-+-+單糖/二塘+-+-寡/多聚糖-+-+脂肪酸+-+-磷脂+-(類)固醇+-2. 分析型超速離心判定大分子純度沉降常數(shù)測定分子量測定檢測大分子中構(gòu)象變化3.1 差速離心法概念：根據(jù)顆粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系數(shù))的差異，通過分級提高離心轉(zhuǎn)速或高速與低速離心交替進(jìn)行使具有不同質(zhì)量的顆粒樣品(或大分子)從混合液中分批沉降至

12、管底，從而實現(xiàn)分離目的。適用于：混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分之間的分離，更準(zhǔn)確地說是沉降系數(shù)差別在l至幾個數(shù)量級的混合樣品的分離，差別越大，分離效果越好。3.1 差速離心法提高血細(xì)胞涂片細(xì)菌檢出率，降低檢菌：常規(guī)涂片易出現(xiàn)G+假陽性、G-假陰性。差速離心處理后涂片檢出率更高。純化病毒：差速離心法提純禽腦脊髓炎病毒效果良好檢出量膿性標(biāo)本(75)非膿血穿刺(63)甩片33經(jīng)差速離心后49153.2 密度梯度離心法概念：用超離心機對小分子物質(zhì)溶液，長時間加一個離心力場達(dá)到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉

13、降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在離心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。Stokes定律：V=d2（-0）g/18。分為等密度梯度離心法和速率區(qū)帶離心法。V顆粒沉降速度d顆粒直徑顆粒密度0介質(zhì)密度g加速度介質(zhì)粘度3.2.1 等密度梯度離心應(yīng)用條件：介質(zhì)能夠自己形成密度梯度且梯度較陡；顆粒密度變化范圍包含于介質(zhì)密度范圍原理：顆粒重力浮力平衡結(jié)果：顆粒所在位置的介質(zhì)密度=顆粒自身密度限制：離心力強，時間長，對細(xì)胞破壞大應(yīng)用舉例：DNA分離與純化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取V顆粒沉降速度d顆粒直徑顆粒密度0介質(zhì)密度g加速度介質(zhì)粘度3.2.2 速率區(qū)帶離心應(yīng)用條件：介質(zhì)能夠自己形成密度梯度且梯度平緩；顆粒密度最小值介質(zhì)密度最大值原理：顆粒沉降系數(shù)不等結(jié)果：顆粒在介質(zhì)中形成一系列分界清晰的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)大的在下面限制：顆粒大小相近的混合物不適用應(yīng)用舉例：菠菜葉綠體RNA的分離純化；小鼠干細(xì)胞線粒體的分離純化3 制備型分離技術(shù)差速離心 vs 密度梯度離心差速離心密度梯度離心分離原理沉降速度差異沉降速度差異&浮力密度差異離心速度由低到高，逐級遞增恒定離心時間單次短