1、洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比擬【摘要】目的克隆紅曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lvE和kH，并進展序列分析和同源性比擬。方法根據(jù)GeneBank土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設計引物，以土曲霉和紅曲霉基因組DNA為模板PR擴增lvE和kH基因并克隆到pD19Tsiple載體。利用DNAAN等軟件以及互聯(lián)網(wǎng)資源對lvE和kH測序結果與其編碼的氨基酸序列進展分析比對。結果分別擴增得到1512bp和1464bp的目的片段lvE和kH。結論lvE和kH同源性很高，并與GeneBank中相關序列根本一樣，是洛伐他汀生物合成酶調(diào)控基因，且其表達產(chǎn)物為GAL4類轉錄因

2、子。【關鍵詞】土曲霉紅曲霉洛伐他汀轉錄因子調(diào)控基因1實驗材料1.1菌株和培養(yǎng)基土曲霉AspergillusterrusTAF93208：中國典型培養(yǎng)物保藏中心;紅曲霉nasusankaI5031：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;大腸桿菌DH5為本實驗室保藏;大腸桿菌LB培養(yǎng)基和LB/Ap培養(yǎng)基均按實驗室常用培養(yǎng)基的配置方法配置。斜面培養(yǎng)基15g/L：察氏培養(yǎng)基蔗糖30g，NaN33g，K2HP41g，gS47H20.5g，Kl0.5g，F(xiàn)eS47H20.01g，瓊脂15g，純潔水1000L。菌絲生長培養(yǎng)基15g/L：葡萄糖50g，酵母膏10g，番茄醬20g，a31g，pH7.27.5。2實驗方法2

3、.1培養(yǎng)方法用2L無菌水沖洗孢子，接入固體斜面培養(yǎng)。固體斜面培養(yǎng)7d后，以5L水洗下，稀釋至濃度為107個/L，取2L參加100L菌絲生長培養(yǎng)基，轉速150r/in，28培養(yǎng)4d。2.3PR引物設計根據(jù)GeneBank上公布的土曲霉和紅曲霉洛伐他汀生物合成基因簇登錄號為AF141925和DQ176595中l(wèi)vE和kH基因設計如下引物擴該基因。lvEF:ATGGTGAGATAAGGTATAT；lvER:TATGGAGGAATATTGTTGAGG；預期lvE產(chǎn)物大小為1512bp。kHF:TTAGGAGGAGGTTGTGTTGG；kHR:ATGGTATGAGTAGG；預期kH產(chǎn)物大小為1464bp

4、。2.4PR反響反響體系：10buffer2L，25l/Lgl21.2L,10l/LdNTPs0.4L,20l/L引物組各0.4L，ddH214.5L，DNA1L，Taq酶0.1L?？傮w系20L。熱循環(huán)條件：94預變性5in后，以9430s，5020s，721in40s程序循環(huán)40次，延伸7220in。2.6轉化子驗證藍白斑挑選挑取白斑單克隆菌落PR驗證。反響體系：10buffer1L，25l/Lgl21.2L,10l/LdNTPs0.2L,20l/L引物組各0.2L，ddH27.15L，DNA無菌槍頭蘸取，Taq酶0.1L。總體系10L。熱循環(huán)條件：94預變性5in后，以9430s，5020

5、s，721in40s程序循環(huán)30次，延伸725in。2.7序列分析比對采用DNAAN軟件將測序結果與GeneBank序列進展比對，并通過NBI等網(wǎng)絡資源分析基因序列及其對應蛋白的理化性質(zhì)、高級構造和功能。3結果與分析3.1PR擴增結果見圖1，說明對lvE和kH擴增得到與預期大小一致的產(chǎn)物，約為1500bp。為DNAarkerDL2000從上至下分別是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；0為陰性對照即沒加模圖1PR擴增結果A為lvE，B為kH略Figure1EletrphresisfPRprdutsn1%agarsegelAfrlvEandBfrkH3.2

6、菌落PR驗證結果見圖2，對lvE和kH擴增得到了與預期大小一致的產(chǎn)物，約為1500bp。A圖中為DNAarker100bpladder從上至下分別是1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；B圖中為DNAarkerDL2000從上至下分別是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；0為陰性對照即沒加模板DNA；A圖中1-9是lvE的菌落PR擴增結果；B圖中1-6是kH的菌落PR擴增結果圖2菌落PR結果A為lvE，B為kH略Figure2Eletrphresisflny

7、PRprdutsn1%agarsegelAfrlvEandBfrkH3.3擴增片段測序結果及分析3.3.1核苷酸及氨基酸分析將重組菌種交英俊生物技術測序，lvE的3次測序結果與GeneBank中l(wèi)vE通過DNAAN比對僅在第614位堿基處由置換了T，編碼的氨基酸也僅在第205位氨基酸處由Ala置換了Val；而kH的3次測序結果與GeneBank中kH完全一致。由此可見兩者之間的差異可能是個體多態(tài)性，也證明了洛伐他汀合成酶調(diào)控基因種間保守程度極高。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3.2亞細胞定位分析亞細胞定位研究.n/SubL/說明lv

8、E和kH蛋白未顯示典型的N端信號肽區(qū)域，SubL分別以84%，94%的準確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預測兩蛋白在核內(nèi)。SignalP分析.bs.dtu.dk/servies/SignalP預測結果顯示兩蛋白均非分泌蛋白，且存在信號肽的可能性分別為10.4%和0。Figure3AdvanedstrutureanalysisAfrlvEprteinandBfrkHprtein圖3中兩蛋白均具有Zn2ys6雙核簇合物的鋅指構造DNA結合構造域，該保守構造域發(fā)現(xiàn)于如GAL4型的轉錄因子，曾在釀酒酵母中證實GAL4為半乳糖誘導的基因表達正調(diào)控子。此構造域由2個螺旋環(huán)繞成富集半胱氨酸的鋅指基序參與Zn依

9、賴性的DNA結合并由無規(guī)那么卷曲串聯(lián)起來。該類構造域還涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸鹽、麥芽糖和半乳糖的代謝，以及酰胺和氨基丁酸的降解與亮氨酸的生物合成等。4討論洛伐他汀是目前治療高血脂癥的常用藥物之一。國內(nèi)工業(yè)化消費洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者們紛紛以增產(chǎn)洛伐他汀為目的開展多方面的研究。目前從基因工程方面著手改善其產(chǎn)量成為熱點。本文克隆的lvE和kH基因編碼產(chǎn)物是一個洛伐他汀生物合成的調(diào)控蛋白或轉錄因子，對其深化研究將有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等將lvE基因突變失活導致檢測不到任何洛伐他汀中間產(chǎn)物，同時將一個額外拷貝的lvE轉化土曲霉，洛伐他汀產(chǎn)量增加

10、57倍10,16。從上述數(shù)據(jù)可以看出對lvE和kH基因以及其編碼蛋白的構造功能的進一步研究將為深化理解洛伐他汀生物合成及其遺傳調(diào)控方面提供參考，且為進一步表達基因、純化相關蛋白、制備多克隆抗體、研究基因體外轉錄、轉錄因子與DNA的體外模擬結合以深化理解該類轉錄因子生物學功能和作用機理奠定了實驗基矗本研究利用國際互聯(lián)網(wǎng)生物信息學資源，通過計算分析兩蛋白物理化學特性，得知此兩核蛋白和一些轉錄因子以及調(diào)控序列編碼產(chǎn)物有共同的GAL4類鋅指構造保守序列區(qū)。相似性搜索比對得知lvE和kH不管基因還是編碼產(chǎn)物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA結合保守序列。3.3.2亞細胞定位分析亞細胞定位研究psrt

11、..n/SubL/說明lvE和kH蛋白未顯示典型的N端信號肽區(qū)域，SubL分別以84%，94%的準確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預測兩蛋白在核內(nèi)。SignalP分析.bs.dtu.dk/servies/SignalP預測結果顯示兩蛋白均非分泌蛋白，且存在信號肽的可能性分別為10.4%和0。Figure3AdvanedstrutureanalysisAfrlvEprteinandBfrkHprtein圖3中兩蛋白均具有Zn2ys6雙核簇合物的鋅指構造DNA結合構造域，該保守構造域發(fā)現(xiàn)于如GAL4型的轉錄因子，曾在釀酒酵母中證實GAL4為半乳

12、糖誘導的基因表達正調(diào)控子。此構造域由2個螺旋環(huán)繞成富集半胱氨酸的鋅指基序參與Zn依賴性的DNA結合并由無規(guī)那么卷曲串聯(lián)起來。該類構造域還涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸鹽、麥芽糖和半乳糖的代謝，以及酰胺和氨基丁酸的降解與亮氨酸的生物合成等。4討論洛伐他汀是目前治療高血脂癥的常用藥物之一。國內(nèi)工業(yè)化消費洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者們紛紛以增產(chǎn)洛伐他汀為目的開展多方面的研究。目前從基因工程方面著手改善其產(chǎn)量成為熱點。本文克隆的lvE和kH基因編碼產(chǎn)物是一個洛伐他汀生物合成的調(diào)控蛋白或轉錄因子，對其深化研究將有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等將lvE基因突變失活導致檢測不到任何洛伐他汀中間產(chǎn)物，同時將一個額外拷貝的lvE轉化土曲霉，洛伐他汀產(chǎn)量增加57倍10,16。從上述數(shù)據(jù)可以看出對lvE和kH基因以及其編碼蛋白的構造功能的進一步研究將為深化理解洛伐他汀生物合成及其遺傳調(diào)控方面提供參考，且為進一步表達基因、