1、精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)專心專注專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)Elisa 相關(guān)試劑的配制 抗體或免疫球蛋白稀釋液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO42H2O 0.39克；Na2HPO41.27克； NaCl0.85克； NaN3200 mg； H2O（蒸餾水） 至 1000ml 2、ELISA洗液及HRP標(biāo)記抗體稀釋液PH7.4，PBST NaCl2.0克； KH2PO40.2克； Na2HPO412H2O 2.9克； KCl0.2克； NaN30.2克； H2O至 1000ml 吐溫（Tween）20 0.5ml； 4C保存?zhèn)溆?

2、包被液（簡(jiǎn)稱CB）pH9.6 Na2CO31.59克； NaHCO32.93克； NaN30.2克 ；H2O至1000ml 密封蓋好，4C存放備用 4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-檸檬酸緩沖液pH5.0 0.1mol/L檸檬酸（21.014克/100ML）24.3ml；0.2mol/LNa2HPO4（28.4克/L)25.7ml；H2O50ml；4C存放備用5、DAB底物液（不溶性底物，組化病理等） 0.05mol/L pH7.6 tris-HCL Tris 6.05克；HCL(36%) 3.15克（約2.7ml濃HCL）； H2O 至1000ml DAB為3，3二氧基聯(lián)苯胺，不溶性底

3、物，呈棕紅色 ELISA試劑配制及實(shí)驗(yàn)流程 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。以雙抗體夾心法舉例說(shuō)明。 試劑配制：(1)包被緩沖液(PH9.6+0.20.05M碳酸鹽緩沖液)：Na2CO31.59g;NaHCO32.93g； 加蒸餾水至1000ml。（用時(shí)稀釋成1x，加0.1%BSA）(2)洗滌緩沖液(PH7.40.15MPBST)：0.05%Tween-200.5ml；加在PBS緩沖液1000ml中。PBS緩沖液：KH2PO40.2g；Na2PO412H2O2.9g；NaCl8g；KCl0.2g；加蒸餾水至1000ml。(3)封

4、閉緩沖液：牛血清白蛋白(BSA)2%2g；（或5%脫脂奶粉）加洗滌緩沖液100ml。(4）稀釋液：牛血清白蛋白0.1%0.1g；加PBS緩沖液100ml。(5）底物緩沖液（PH5.0）：0.2MNa2HPO4(無(wú)水28.4g/L，帶12結(jié)晶水71.7g/L)取25.7ml0.1M檸檬酸(無(wú)水19.2g/L，帶1結(jié)晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸餾水至100ml。(或Na2HPO412H2O1.84g；檸檬酸H2O0.51g加蒸餾水至100ml) (6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液（顯藍(lán)色）：TMB(2mg/ml水)0.05ml；底物緩沖液0.95ml；30%H2O2 0.001ml；

5、總體積1ml。 (7)或配OPD(鄰苯二胺)顯色液（顯黃棕色）（現(xiàn)配避光）：OPD（干粉）0.004g；底物緩沖液10ml；30%H2O20.015ml；總體積10ml。(8)終止液(2MH2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入濃硫酸(18M，約98%)21.7ml，邊加邊搖。操作步驟： 1.包被：用包被液將抗體（一抗）稀釋至蛋白質(zhì)含量為110g/ml。在每板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過(guò)夜（或37溫育23小時(shí)）。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液沖洗3次，中間振蕩。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 2.封閉：加0.3ml封閉液于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37溫育2小時(shí)。然后洗滌3次 3.加樣：加待檢樣品0.1

6、ml于反應(yīng)孔中，置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔（不加樣品），陰性對(duì)照孔（野生型）及陽(yáng)性對(duì)照孔)。4.加一抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的抗體0.1ml。置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。 5.加酶標(biāo)二抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37溫育45分鐘1小時(shí)，洗滌5次。6.加底物液顯色：各反應(yīng)孔中加入剛剛配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD顯色液），37暗處溫育520分鐘，或室溫暗處1040分鐘充分變色。7.終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物藍(lán)色變黃色，OPD底物黃色變棕色）8.結(jié)果判定：白色背景上肉眼直接觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性

7、反應(yīng)為無(wú)色或極淺，可以依據(jù)所呈顏色的深淺，用“+”、“-”號(hào)表示測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，TMB底物法使用450nm測(cè)各孔OD值，OPD底物法使用492nm檢測(cè)。通常大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性(以空白對(duì)照孔調(diào)零后計(jì)算)。4 間接法操作步驟： 1.包被：用包被液將樣品稀釋（梯度稀釋，比例自己定）4過(guò)夜（或37溫育23小時(shí)）。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液沖洗3次（5至7次），中間振蕩。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 2.封閉：加0.3ml封閉液于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37溫育2小時(shí)。然后洗滌。3.加一抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的抗體0.1ml。置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。4.加酶標(biāo)

8、二抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37溫育45分鐘1小時(shí)，洗滌5次。5.加底物液顯色：各反應(yīng)孔中加入剛剛配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD顯色液），37暗處溫育520分鐘，或室溫暗處1040分鐘充分變色。6.終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物藍(lán)色變黃色，OPD底物黃色變棕色）7.結(jié)果判定：白色背景上肉眼直接觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，可以依據(jù)所呈顏色的深淺，用“+”、“-”號(hào)表示測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，TMB底物法使用450nm測(cè)各孔OD值，OPD底物法使用492nm檢測(cè)。通常大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.

9、1倍，即為陽(yáng)性(以空白對(duì)照孔調(diào)零后計(jì)算)。孕酮1包被緩沖液，（1）碳酸鹽緩沖液（PH9.6 +0.2 0.05M） Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸餾水至1000ml。（2）tris緩沖液（0.05mol/L）50ml 0.1mol/L（Tris）溶液與x ml 0.1mol/L 鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml 各種pH值的Tris緩沖液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的體積714577244773434744207540376385773667834579320802928. 126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.

10、48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應(yīng)體積（單位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調(diào)至100ml0.1mol/L鹽酸的配置： 買來(lái)的濃鹽酸是 12 mol/L的，以配制1L 0.1mol/L的鹽酸為例：先用量筒量取8.3 mL的濃鹽酸倒入容量瓶，然后將溶液加蒸餾水稀釋至體積為1 L，此時(shí)的溶液就是0.1mol/L的鹽酸。0.1mol/Ltris的配置：0.1 mol/L溶液為12.114 g/L則 配制600mlTris緩沖液的方法： 三羥甲基氨基甲烷： 3.6g

11、 濃鹽酸： 2.09ml3）0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)磷酸二氫鉀 0.2g ；磷酸氫二鈉2.90g；氯化鈉 8g；加去離子水定容到1000ml。2洗滌緩沖液（pH7.4 0.15mol/L） 0.05%Tween-200.5ml；加在PBS緩沖液1000ml中。PBS緩沖液：KH2PO4 0.2g；Na2HPO412H2O2.9g；NaCl8.0g；KCl0.2g加蒸餾水至1000ml。3測(cè)定緩沖液(Ph7.0 含0.87NaCl 和0.1BSA的0.1M磷酸緩沖液)用于標(biāo)準(zhǔn)孕酮，孕酮酶標(biāo)物及奶樣的稀釋。 Na2HPO412H2O 21.85g；NaH2PO42H2O6.08

12、g；NaCl8.70g；BSA1.00g溶于1000mL蒸餾水中4封閉緩沖液 牛血清白蛋白(BSA) 2%2g；（或5%脫脂奶粉）加洗滌緩沖液100 ml。0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml5底物緩沖液（pH5.4）磷酸鹽-檸檬酸緩沖液 0.2M Na2HPO4(無(wú)水28.4g/L，帶12結(jié)晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 檸檬酸(無(wú)水19.2g/L，帶1結(jié)晶水21.01g/L) 取24.3ml加蒸餾水至100ml?；?檸檬酸（C6H8O7H2O）0.47g；Na2HPO412H2O

13、2.00g；6（1） TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液（藍(lán)色）A液(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，TMB):稱取TMB20mg溶于10ml無(wú)水乙醇中，完全溶解后，加雙蒸水至100ml。B液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4):稱取Na2HPO412H2O14.34g，檸檬酸1.87g溶于180ml雙蒸水，加0.75%過(guò)氧化氫尿素1.28ml，定容至200ml，調(diào)pH至5.0-5.4。將A液和B液按1：l混合后即成TMB-過(guò)氧化氫尿素應(yīng)用液或TMB(2mg/ml水) 0.05ml： 底物緩沖液 0.95ml； 30% H2O20.001ml；總體積1ml。

14、（2）OPD(鄰苯二胺)顯色液（黃棕色）（現(xiàn)配避光） OPD（干粉）0.004g；底物緩沖液10ml；30%H2O2 0.015ml；總體積10ml。 （3）TMBS底物液（用于顯色）10mg四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽（TMBS）的二甲基亞砜溶液，用底物緩沖液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加H2O2溶液30左右。7 終止液 2mol/L H2SO4 用于終止反應(yīng)在178.3ml水中，逐滴加入濃硫酸(18M，約98%)21.7ml，邊加邊搖。（濃H2SO4：蒸餾水=1:9）抗原修復(fù)液：根據(jù)待檢測(cè)的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǜ剑嚎乖迯?fù)液（10mM pH6.0 枸櫞酸鈉緩沖液）的配制 （1）儲(chǔ)備液的

15、配制：A：枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g+1000mlB:枸櫞酸21g+蒸餾水 1000ml工作液的配置：A液82ml+B液18ml+蒸餾水900ml抗原修復(fù)方法：高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM,PH6.0）,淹沒(méi)切片，蓋上高壓鍋，高壓鍋內(nèi)煮沸，上汽3分鐘后緩慢冷卻（可用自來(lái)水在高壓鍋外沖，以助冷卻）微波處理技術(shù)：用塑料切片架，置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸鈉緩沖液淹沒(méi)切片，選擇中或高檔，5分鐘；取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液；再選擇中或高檔，5分鐘（最佳溫度9295）抗原修復(fù)注意事項(xiàng)：組織不能干，選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。該方法主要用于10%福爾馬林固定，石蠟包埋組織。

16、抗原修復(fù)后至DAB顯色的過(guò)程中，均要用PBS緩沖液。DAB的配制：儲(chǔ)備液（DAB 25mg/ml）的配置：DAB250mg+pbs10ml，待完全溶解后分裝成1ml,100ul。50ul，20ul，等20凍存。工作液：DAB儲(chǔ)存液20ul+PBS1000ul+3%H2O2 5ul;20.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。 30.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH調(diào)至ph8.0, 加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS緩沖液

17、（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0, 加水1000ml。 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7. 風(fēng)裱劑：a.甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制 8TBS/PBS PH9.09.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;ph7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本 二抗稀釋劑: 0.05% 疊氮鈉; 0.01M 磷酸緩沖液(PBS) pH7.2 (注: 1

18、升) 注備: 1) 二抗稀釋劑可以儲(chǔ)存在4 C , 6 個(gè)月. 2) 不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀釋劑來(lái)稀釋二抗,因?yàn)槎箍赡軙?huì)與牛血清白蛋白或其它血清反應(yīng). 3)用TBS稀釋二抗會(huì)降低染色, 因此TBS用于有強(qiáng)背景的抗體活堿性磷酸酶標(biāo)記得二抗,因?yàn)榱姿猁}可以抑制堿性磷酸酶的活性. 辣根過(guò)氧化酶-鏈霉親和素(HRP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀釋劑: 0.01M 磷酸緩沖液(PBS) pH7.2 (注: 1升) 0.05% 硫柳汞 注備:此稀釋劑可以儲(chǔ)存在4 C , 6 個(gè)月. 堿性磷酸酶-鏈霉親和素(AP-Streptavidin Dilution

19、Buffer) 稀釋劑:0.05M Tris緩沖液 (TBS), pH 7.6 ;0.05% 硫柳汞 注備: 1) 此稀釋劑可以儲(chǔ)存在4 C , 6 個(gè)月. 2) 磷酸緩沖液不能用來(lái)稀釋堿性磷酸酶-鏈霉親和素,因?yàn)榱姿猁}回抑制堿性磷酸酶活性. 熒光染料 (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) 稀釋劑: 0.01M 磷酸緩沖液(PBS) pH7.2 (注: 1升) 0.05% 硫柳汞熒光封片劑熒光染色封片劑有幾種：1緩沖甘油封片介質(zhì)(常用)0.5molL碳酸鹽緩沖液(pH8.5)，lOml；無(wú)熒光甘油(AR級(jí))，90ml,混合后在上充分混勻。2聚

20、乙烯醇緩沖甘油混合介質(zhì)0.5molL碳酸鹽緩沖液(pH8.5)，40ml；1聚乙烯醇，lOml；分析純甘油，lOml。三液混合后，不斷攪拌6h，72000g離心1h，吸取上清4保存?zhèn)溆谩?熒光信號(hào)增強(qiáng)封片劑聚乙烯醇40-88，4.8g；分析純甘油，12ml；蒸餾水，12ml；0.2molLTris鹽酸緩沖液(pH85)，24ml；l，4重氮雙環(huán)2，2，2辛烷，L25g(終濃度約25)。另外有供應(yīng)抗熒光衰減封片劑，以高純度甘油為介質(zhì)，內(nèi)含抗熒光淬滅劑，有強(qiáng)烈的抗熒光衰減作用，用于對(duì)熒光組織和細(xì)胞樣品的封片。樣品封片后4oC或20oC避光保存2-3周，可最大限度延長(zhǎng)熒光持續(xù)時(shí)間和維持熒光發(fā)光強(qiáng)度，

21、同時(shí)封片劑中的其它成分有助于保持組織抗原抗體處于結(jié)合狀態(tài)。適用于所有光譜范圍的熒光如FITC，Cy2,Cy3,Rhodamine,TexasRed,Cy5,Cy7，DAPI,AMCA,R6G,Hoechst33258and33342。|熒光封片劑配制：稱取NaHC033.7克，無(wú)水Na2C030.6克溶于100m1三蒸水中，然后與甘油1:1混合，4保存。200微升的甘油和800微升的0.01M的PBS 伊紅（1）伊紅（水溶性）配方：伊紅 （水溶性） 2.5-5 g 水 500 ml將水溶性伊紅溶于水中，然后加濃鹽酸10毫升，充分?jǐn)嚢?，靜置過(guò)夜后過(guò)濾。過(guò)濾后的沉淀用蒸餾水沖洗二次，再過(guò)濾；將沉淀

22、物連同一起放入溫箱內(nèi)干燥，加95%酒精1000毫升，配成飽和液。使用前再用95%的酒精 1:12倍稀釋，加入12%冰醋酸。此方法具有染色時(shí)間快，顏色鮮艷，不容易褪色，使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。 （2）伊紅（醇溶性）配方：伊紅 （醇溶性） 2.5-5g 75%酒精 1000 ml，加幾滴冰醋酸至半透明狀TAE緩沖液TAE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點(diǎn)是超螺旋在其中電泳時(shí)更符合實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量（TBE中電泳時(shí)測(cè)出的相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)大于實(shí)際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，電泳大于13kb的片段時(shí)用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時(shí)也易用TAE緩沖系統(tǒng)

23、進(jìn)行電泳。TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量小，長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過(guò)夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。 50TAE Buffer 配制方法： 1。稱量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L燒杯中； 2。向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?3。加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。 使用時(shí)稀釋50倍 即1TAE Buffer（5）TBE緩沖液1L名稱：TBE（Tris硼酸），是一種PCR技術(shù)中用到的緩沖液。445 mmol/L Tris堿54g ;445 mmol/L 硼酸鹽27.5g 硼酸

24、； ；10 mmol/L EDTA20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） ；水補(bǔ)足1LTRIS是一種最常用的生物緩沖液，常配成PH值為6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值隨溫度變化很大。一般來(lái)說(shuō)，溫度每升高一度，PH值下降0.03。 1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS最常用的試劑。 而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。TE為 Tris加EDTA合稱。 CAPS現(xiàn)在蛋白質(zhì)的PVDF轉(zhuǎn)膜已經(jīng)不用Tris-gly、SDS、20%甲醇緩沖液:，因?yàn)榫彌_液中有甘氨酸，所以測(cè)序的時(shí)候

25、很難區(qū)分甘氨酸是BUFFER帶進(jìn)去還是蛋白質(zhì)本身的?，F(xiàn)在測(cè)序用的轉(zhuǎn)膜緩沖液是：10mM/l CAPS,10%的甲醇。CAPS電印跡緩沖液中的甲醇濃度范圍是020%，一般甲醇濃度高的緩沖液對(duì)低分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效果好，而甲醇濃度低甚至不含甲醇的緩沖液則有利于高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。配制CAPS電印跡緩沖液。方法如下：10CAPS（100mmol/L）CAPS 22.3g；加去離子水至900ml；用2mol/L NaOH（約20ml）將pH值調(diào)至11.0，然后定容至1L，貯存于4。CAPS電印跡緩沖液（含10%甲醇的1CAPS）：10CAPS 200ml；甲醇 200ml；去離子水 1600mlstripping1、stripping buffer 含有適量的SDS，在低ph值或適當(dāng)?shù)臏囟认拢梢允鼓ど系拇蠖鄶?shù)抗原抗體復(fù)合物分開(kāi)。使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。2、完全可以用同一種抗體再雜交一次。我的經(jīng)驗(yàn)是同一張膜stipping3次就差不多了，而且用同一種一抗，信號(hào)強(qiáng)度是一次比一次遞減的。strip的配方有多種，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一個(gè)，那就是使膜上的抗原抗體復(fù)合