1、第十四章 固定化細胞發(fā)酵Fermentation with immobilized cells第一節(jié)概述、定義固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，既細胞受到物理化學等因素約束或限 制在一定的空間界限內(nèi)，但細胞仍保留催化活性并具備能被反復或連續(xù)使用的活力。 是在酶固定化基礎上發(fā)展起來的一項技術(shù)。二、固定化細胞的優(yōu)點1，與游離細胞相比 與游離細胞發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵具有以下優(yōu)點：（1）固定化細胞可以將微生物發(fā)酵改為連續(xù)酶反應（2）可以獲得更高的細胞濃度；（3）細胞可以重復使用；（4）在高稀釋率時，不會產(chǎn)生洗脫現(xiàn)象；（5）單位容積的產(chǎn)率高；（6）提高遺傳穩(wěn)定性；（7）細胞不會受到剪切效應的影響。

2、（8）發(fā)酵液中菌體含量少，有利與產(chǎn)品的分離純化。 2，與固定化酶相比 與固定化酶相比，固定化細胞具有以下優(yōu)點：（1）免去了破碎細胞提取酶的手續(xù)（2）酶在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，完整細胞固定化后酶活性損失少（3）固定化細胞制備的成本比固定化酶低（4）無需輔酶再生三、固定化細胞的缺點 雖然固定化細胞具有上述許多優(yōu)點，但也有不足之處，具體表現(xiàn)在 1，僅能利用胞內(nèi)酶； 2，細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用； 3，載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性；4，可能有副反應。四、固定化細胞的分類1，按固定的細胞類型不同分為三類：（1）微生物；（2）動物；（3）植物。2，按細胞的生理狀態(tài)不同分為兩大類：

3、（1）死細胞：包括完整細胞、細胞碎片、細胞器。適用于一種酶催化的反應。（2）活細胞：包括增殖細胞、靜止細胞、饑餓細胞。適用于多酶反應，特別是 需要輔酶的反應。第二節(jié)細胞固定化的方法第二節(jié)細胞固定化的方法細胞固定化方法有：Adsorption （吸附）；covalent bonding （共價結(jié)合）； Cross linking （交聯(lián)）；Entrapment （包埋）、Encapsulation （微膠囊）。下面對這幾 種做具體介紹。一、吸附法1，原理利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力（van der Walls forces）,使細胞吸附 于載體上。吸附法可分為物理吸附和離子吸附兩種。該法

4、操作簡單，固定化過程對 細胞活性影響小。2，載體的材料 采用吸附法固定細胞，所用的載體主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、 多孔陶瓷、離子交換樹脂和等。塑料3，影響吸附固定化的因素（ 1 ） Z- 電位（2）細胞的性質(zhì)和細胞壁的組成（3）載體的性質(zhì)（ 4） pH二、共價結(jié)合法利用細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無 機或有機載體反應，形成共價鍵將細胞固定。用該法制備的固定化細胞一般為死細 胞。三、交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、 咪唑基）反應，從而使細胞固定。常用的交聯(lián)劑包括：戊二醛、甲苯二異氰酸酯、 雙重氮聯(lián)苯胺。

5、由于交聯(lián)試劑的毒性，這一方法具有一定的局限性。四、包埋法 包埋法是細胞固定化最常用的方法。包埋法可以分為： 1，微膠囊法：利用半透性聚合物薄膜將細胞包裹起來，形成微型膠囊； 2，凝膠包埋法：是在無菌條件下，將生物細胞和膠溶液混合在一起，然后再經(jīng) 過相應的造粒處理，形成直徑為 1-4mm 的膠粒。常用的包埋劑為：聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二醋酸纖維、三醋酸 纖維、明膠等。五、固定化方法的比較 吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。但操作穩(wěn)定性差。 共價法：操作穩(wěn)定性高。但由于試劑的毒性，易引起細胞的破壞。 交聯(lián)法：可得到高細胞濃度，但機械強度低，無法再生，不適于實際應用。 包埋法：細胞

6、和載體間沒有束縛，固定化后，細胞仍保持較高活力。但這類方 法只適用于小分子底物。第三節(jié)固定化細胞的形狀及性質(zhì)一、形狀 固定化細胞由于其用途和制備方法不同，可以是顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀 或不規(guī)則狀等。但目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體。二、性質(zhì)1，最適 pH細胞經(jīng)固定化后，其最適 pH 因固定化方法不同而有一些調(diào)整。如，用聚丙烯 酰胺包埋的大腸桿菌中的天門冬氨酸酶和產(chǎn)氨短桿菌中的延胡索酸酶的最適 pH 向 酸性范圍偏移。但用同一方法包埋的大腸桿菌中的青霉素酰胺酶的最適 pH 則沒有 變動。2，溫度類似與pH,細胞固定化方法不同，也有可能導致最適溫度產(chǎn)生不同的變化。 3，穩(wěn)定性一般而言，細胞經(jīng)固定化

7、后，其穩(wěn)定性會有所提高。第四節(jié) 固定化細胞反應器、固定化細胞反應器的優(yōu)點A higher cell concentration in the immobilised bioreactor prevents themicrobial population from completely washing out. 固定化細胞反應器具有以下優(yōu)點： 1，在固定化細胞反應器中采用高稀釋率有以下優(yōu)點： 2，生產(chǎn)強度、轉(zhuǎn)化率高； 3，與衡化器相比，固定化細胞反應器具有更好的穩(wěn)定性； 4，節(jié)省投資和能耗。二、固定化細胞反應器的類型固定化細胞反應器包括以下幾種類型：細胞再循環(huán)系統(tǒng)(Cell recycle sy

8、stems )、 固定床反應器(Fixed bed reactors )、流化床反應器(Fluidized bed reactors )、絮凝細胞系統(tǒng)( Flocculated cell systems )。1、細胞再循環(huán)系統(tǒng)(Cell recycle systems )In a fermenter with cell recycle the cells are separated from the effluent and then recycled back to the fermenter; thus minimising cell removal from the fermenterC

9、ell recycle is used in activated sludge systems. A portion of the cells are separated in a settling tank and returned to the activated sludge fermenter.Biomass recycling for product or biomass production is more difficult due to the need for maintaining sterility during cell separation. Centrifugati

10、on which is a faster process than settling would be used to separate the cells.Biomass recycle systems can be easily modelled.2、固定床反應器( Fixed bed reactors )In fixed bed fermenters, the cells are immobilized by absorption on or entrapment in solid, non-moving solid surfaces.In one type of fixed bed f

11、ermenter, the cells are immobilized on the surfaces of immobile solid particles such as plastic blocks, concrete blocks, wood shavings or fibrous material such as plastic or glass wool.Fixed bed reactorsThe liquid feed is either pumped through or allowed to trickle over the surface of the solids whe

12、re the immobilized cells convert the substrates into products.Once steady state has been reached there will be a continuous cell loss from the solid surfaces. These types of fermenters are widely used in waste treatment In other types of fixed-bed fermenters, the cells are immobilized in solidified

13、gels such as agar or carrageeninIn these fermenters, the cells are physically trapped inside the pores of the gels and thus giving better cell retention and a large effective surface area for cell entrapment. In order to increase the surface area for cell immobilization, some researchers have invest

14、igated the use of hollow fibres and pleated membranes as immobilization surfaces. Industrial applications of fixed bed reactors include waste water treatment, production of enzymes and amino acids, and steroid transformationsOne advantage fixed bed reactors is that non-growing cells can be used. In

15、such systems, the cells enzymatically act on substrates in the feed. The cells can be either inactivated or not fed nutrients required for growth.3、流化床反應器(Fluidized bed reactors)The fluidisation of the particles in the reactor leads to the surface of the particles being continuously turned over. Thi

16、s also increases the mass transfer rate.Fluidised beds are typically categorized as either being a 2 phase system which are not aerated and 3 phase system which is aerated by sparging口 口 _Fluidized bed reactorsFluidized bed bioreactors are used widely in wastewater treatment. Fluidized bed bioreacto

17、rs are also used for animal cell culture. Animal cells are trapped in gels or on the surface of special particles known as microcarriers. Fluidized bed reactors are one example of perfusion culture technology used for animal cell culture.Comparing fluidised bed and fixed reactorsFluidised bed reacto

18、rs are considerably more efficient than fixed bed reactors for the following reasons:A high concentration of cells can be immobilized in the reactor due to the larger surface area for cell immobilization is availableMass transfer rates are higher due to the larger surface area and the higher levels

19、of mixing in the reactor.Fluidised bed reactors do not clog as easily as fixed bed reactors.Fluidised bed reactors are however more difficult to design than fixed bed reactors. Design considerations include:Setting the flow rate to achieve fluidisationEnsuring that bubble size remains small during t

20、he fermentation.Prevention of the cells from falling or sloughing off the particles.Minimising particle damage.4、絮凝細胞系統(tǒng)(Flocculated cell systems)In flocculated cell reactors, the cells are trapped in the reactor due to an induced or natural flocculation process. In flocculation cells tend to group t

21、ogether causing them to come out of solution and to sink towards the base of the reactor.Flocculated cell reactors are used widely in anaerobic waste treatment processes. In these reactors, the methanogenic and other bacteria form natural flocs. The flocs move due to the release of methane and carbo

22、n dioxide by the cells.The reactors are typically egg-shaped.Cells form flocs which gently fall and nse with gases they produceFlocculated cell reactors第五節(jié) 固定化細胞的應用目前固定化細胞已成功地應用在以下領(lǐng)域1，抗生素的生產(chǎn)2，有機酸的生產(chǎn)3，氨基酸的生產(chǎn)4，酶制劑的生產(chǎn)5，生物轉(zhuǎn)化6，廢水處理7，基因工程菌的固定化一、抗生素的生產(chǎn)抗生素是次級代謝產(chǎn)物，屬非生長關(guān)聯(lián)型，以游離細胞采用連續(xù)發(fā)酵很難生產(chǎn) 抗生素?？股氐陌l(fā)酵為非生長關(guān)聯(lián)型，因此

23、生長和代謝產(chǎn)物合成階段所需的營養(yǎng) 條件不同。從理論上，阻止固定化細胞的增殖是可能的，因而可以使用較稀的培養(yǎng) 基來連續(xù)合成抗生素。二、有機酸的生產(chǎn)檸檬酸是有機酸中的主要品種，檸檬酸一般是以黑曲霉為菌種來生產(chǎn)。在發(fā)酵 過程中，由于菌體的生長，導致發(fā)酵液粘度的上升，會影響氧的傳遞。而采用固定 化細胞技術(shù)，由于生長被抑制，因而不會影響氧的傳遞。三、氨基酸的生產(chǎn)例如固定化Escherichia coli和Pseudomonas putida,將D, L-絲氨酸和吲哚轉(zhuǎn)化 為L-色氨酸。在200升的反應器中，L-色氨酸的產(chǎn)率可達到110g/L。絲氨酸和吲 哚的摩爾轉(zhuǎn)化率可分別達到 91%和 100%。這一

24、過程可以連續(xù)化操作。四、酶制劑的生產(chǎn)五、生物轉(zhuǎn)化六、廢水處理1,處理氨、氮廢水微生物去除氨氮需經(jīng)過硝化、厭氧反硝化兩個階段。硝化菌、脫氮菌的增殖速 度慢,要想提高去除率,必須要較長的停留時間和較高的細胞濃度。采用固定化細 胞技術(shù)可以做到這點。固定化細胞技術(shù)在處理氨氮廢水中的主要優(yōu)勢在于可通過高 濃度的固定細胞，提高硝化和反硝化速度，同時還可以使在反硝化過程低溫時易失 活的反硝化菌保持較高活性。2，含酚廢水含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產(chǎn)率高，易產(chǎn)生污泥流 失，處理效率低等缺點。固定化細胞對廢水中酚類等有毒物質(zhì)的降解能力遠大于游 離細胞。3，含芳香烴廢水 利用固定化混合菌群可降解芳香