1、分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用 馬建蘋Tel:(O) E-mail: 超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理1. 超臨界流體的特性 相態(tài)性質(zhì) 氣體 超臨界流體 液體密度(kg/m3) 1.0 7.0102 1.0103黏度(Pas) 10-610-5 10-5 10-4擴(kuò)散系數(shù)(m2/s) 10-5 10-7 10-9(1)被提取物的性質(zhì)(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響2. 超臨界CO2流體的溶解性能3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì)(1)防止熱敏性物質(zhì)可能產(chǎn)生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無溶劑殘留問題。(3)實(shí)現(xiàn)選擇性提取。(4)提取較完

2、全。(5)儀器聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)高效、快速、準(zhǔn)確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業(yè)化生產(chǎn)。蜂膠的SFE純化流程(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時(shí)間(5)粒度(6)夾帶劑二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體95%乙醇提取穿心蓮內(nèi)酯脫水穿心蓮內(nèi)酯總內(nèi)酯含量總內(nèi)酯提取率色澤氣味雜質(zhì)有效成分制藥干燥損失成藥中藥粉流動(dòng)性藥粉外觀藥粉氣味藥效19%12%42%98%墨綠色(原藥色)原藥香味少1/10好墨綠色、干爽、油脂多含原料藥香氣好、穩(wěn)定10%4%24%60%深棕色焦味多1/3差棕色、結(jié)塊、油脂少無差、不穩(wěn)定2.揮發(fā)油的提取

3、傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)：易造成揮發(fā)油的分解或氧化等； 收率普遍較低實(shí)例：月見草油 SFE提取, 25 MPa, 50 萃取率 20% -亞麻酸 10.6% 色澤與透明度 -亞麻酸 杏仁油： SFE與石油醚提取工藝比較 收油率是后者的2.5倍 薄荷揮發(fā)油： 23 MPa, 55 加7% 乙醇夾帶劑 薄荷醇收率 0.16% 比水蒸汽蒸餾法 高 3倍 比有機(jī)溶劑法 高0.6倍 優(yōu)于溶劑法四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)(2)對(duì)許多強(qiáng)極性和分子量較大的成分很難進(jìn)行有效地提取(3)基礎(chǔ)研究比較薄弱(4)需要結(jié)合傳統(tǒng)中藥所要求的藥效來考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩(wěn)定(5)考慮

4、中藥成分的協(xié)同和互溶作用 牌號(hào) 生產(chǎn)廠 結(jié)構(gòu) 比表面積 孔徑（nm）非極性 Amberlite XAD-2 羅姆哈斯（美） PS 330 4.0 Amberlite XAD-3 羅姆哈斯（美） PS 526 4.4 Amberlite XAD-4 羅姆哈斯（美） PS 750 5.0 ADS-5 南開大學(xué) PS 550 20-25 ADS-3 南開大學(xué) PS 1000 5-6 Amberlite XAD-6 羅姆哈斯（美） -COOR 498 6.3 Amberlite XAD-7 羅姆哈斯（美） -COOR 450 8.0 ADS-8 南開大學(xué) -COOR 140 25.0 Amberlit

5、e XAD-9 羅姆哈斯（美） Amberlite XAD-10 羅姆哈斯（美） 250 8.0 ADS-16 南開大學(xué) 酰胺 69 35.2 Amberlite XAD-11 羅姆哈斯（美） 氧化氮類 170 Amberlite XAD-12 羅姆哈斯（美） 氧化氮類 25 21.0 ADS-7 南開大學(xué) -NR 200 130一些代表性的大孔吸附樹脂2. 大孔吸附樹脂的特點(diǎn)(1)分離性能優(yōu)良 選擇性良好 分離效能高 脫色能力強(qiáng)(2)理化性質(zhì)穩(wěn)定 穩(wěn)定性高 機(jī)械強(qiáng)度好 經(jīng)久耐用 避免環(huán)境污染和對(duì)設(shè)備的腐蝕(3)應(yīng)用范圍廣 與離子交換樹脂相比 pH不變 發(fā)酵液分離抗生素(4)使用方便 流體阻力

6、小(5)溶劑用量少 避免乳化現(xiàn)象 提高提取效率(6)可重復(fù)使用 再生容易(7)其他方面 價(jià)格較貴 吸附效率易受流速和溶質(zhì)濃度的影響 品種有限 操作較復(fù)雜 對(duì)樹脂的技術(shù)要求較高藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預(yù)處理（3）上柱工藝條件的選擇 樹脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹脂的解吸 樹脂的清洗、再生： 無水乙醇或95乙醇洗至無色，大量水洗去醇三.大孔吸附樹脂技術(shù) 在天然藥物提取純化中的應(yīng)用在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎(chǔ)2.不斷有新型的吸附樹脂問世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷

7、類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離1.黃酮類藥物的提取實(shí)例：銀杏葉提取物 （GBE） 主要有效成分 黃酮苷 萜內(nèi)酯 溶劑萃取法 24 6 樹脂吸附法 Amberlite XAD-7 30 未達(dá)標(biāo) Duolite-761 達(dá)標(biāo) 達(dá)標(biāo) ADS-F8 6065 2530 其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等2.皂苷類藥物的提取實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷 研制出強(qiáng)極性吸附樹脂ADS-7、S-038 S-038，吸附量達(dá)65.5 mg/ml，70乙醇洗脫 人參皂苷 吸附和脫色雙重作用 ADS-7 ，70乙醇洗脫，粗品（棕色） 白色或微黃色實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷 絞股藍(lán)：葫蘆科植物絞股藍(lán)的根狀莖或全

8、草，多年生草質(zhì)藤本植物 功效：鎮(zhèn)咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類 “綠色的金子” “第二人參” “人參寶草”提取工藝：絞股藍(lán)干莖葉 熱水浸提 浸提除雜 樹脂吸附乙醇解吸 脫色 濃縮干燥 粉碎 絞股藍(lán)皂苷粉末7-8倍熱水浸提三次調(diào)節(jié)酸堿性靜置除雜DA大孔樹脂水洗除雜50%乙醇70%乙醇DB樹脂真空干燥80-100目3.生物堿的提取實(shí)例：喜樹堿 弱堿 AB-8 pH 8，鹽濃度(1-2.5)mol/L, 吸附量達(dá)160 mg/g 小檗堿 堿性大 水溶性大 10%H2SO4, 10%NaOH, 非極性吸附樹脂 小檗堿含量為原生藥含量的97%制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：有效成分的定性與定量工作開發(fā)

9、出療效好、質(zhì)量指標(biāo)明確的中藥新藥一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜 操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、應(yīng)用廣泛新型薄層色譜法 離心制備薄層色譜 （PCLC）旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的圓形色譜技術(shù)，分離效果優(yōu)于常規(guī)的制備薄層色譜和柱色譜獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)固定相不會(huì)造成損壞 裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高實(shí)例：龍膽屬植物 Sstrictiffora 甲醇提取物 bellidifolin 和 desmethylbellidifolin 離心薄層色譜法 聚酰胺開口柱色譜 30 min. 12hr.2.柱色譜特殊的柱色譜：

10、（1）干柱色譜干法裝填上樣洗脫推出、切割譜帶溶劑萃取特點(diǎn)：溶劑消耗很少，操作迅速（1530min）（2）真空液相色譜 (VLC)抽真空裝柱低極性溶劑沖柱上樣洗脫收集餾分、抽干特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、處理量大（一次可達(dá)30g）3.壓力液相色譜 (PLC)閃蒸色譜 (約0.2 MPa) 價(jià)格低廉、操作方便低壓液相色譜 ( 2.0 MPa) 分離效率高、應(yīng)用范圍廣實(shí)例：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯的分離純化硅膠H柱 (10-40 m) 流動(dòng)相：乙酸乙酯石油醚（8：2）(5) 超臨界流體色譜 介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點(diǎn)：分離速度快、產(chǎn)品易回收、應(yīng)用范圍廣、有可能替代正相HPLC4.離子交換色

11、譜固定相：離子交換樹脂 可再生性和重復(fù)使用性交換功能基團(tuán)：陽離子和陰離子形態(tài)：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點(diǎn)：使用方便、成本低廉、重復(fù)使用性好、分離速度快應(yīng)用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸實(shí)例：總生物堿制備生藥粗粉0.1%HCl滲漉強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂蒸餾水洗樹脂倒出晾干10%NaOH堿化樹脂氯仿回流干燥重結(jié)晶 5.逆流色譜 (CCC)以液相物質(zhì)為固定相的液液色譜離心逆流色譜 (CCCC)：（1）分離物質(zhì)的極性范圍很寬（2）沒有拖尾現(xiàn)象（3）樣品定量回收實(shí)例：銀杏葉中的黃酮糖苷 固定相：水，流動(dòng)相：乙酸乙酯乙酸乙酯（異丁醇）乙酸乙酯/異丁醇 (6:4)高速逆流色譜 (H

12、SCCC)6.其他形式色譜體積排阻色譜 分子篩機(jī)理凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快捷、流動(dòng)相選擇寬泛(2)親和色譜 大多被利用來分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜 主要分離對(duì)象為蛋白質(zhì)特點(diǎn)：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質(zhì)的活性7.多種色譜方法的聯(lián)用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過濾色譜等最后的純化過程：如HPLC實(shí)例：生物堿 液相色譜法排阻色譜法實(shí)例：水飛薊黃酮的提取 水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本 功效：抗肝臟中毒和保護(hù)肝細(xì)胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子 去油種子餅 去油種子渣 過濾 提取液 濃縮

13、 總黃酮油液 總黃酮 溶解 上柱 洗脫 濃縮干燥 水飛薊素機(jī)械榨油粉碎提取4次每次4h分離植物油丙酮硅膠柱四. 制備色譜技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵：色譜過程放大和操作最優(yōu)化柱色譜：分辯率高、結(jié)合容量大、成本低、放大快速簡(jiǎn)便 現(xiàn)有色譜分離工藝70連續(xù)性色譜技術(shù)：移動(dòng)床色譜、環(huán)形色譜、錯(cuò)流梯度色譜 模擬流動(dòng)床SMB： 特點(diǎn)：設(shè)備結(jié)構(gòu)小、放大快速簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高和生產(chǎn)能力大指紋圖譜技術(shù)一.概述1.中藥指紋圖譜： 運(yùn)用光譜、色譜、X-射線衍射或各種技術(shù)的聯(lián)用等現(xiàn)代分析技術(shù)，對(duì)中藥化學(xué)信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖等）方式進(jìn)行表征，并通過計(jì)算、分析、比較、評(píng)價(jià)等過程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說明。

14、 制備分析比較評(píng)價(jià)校驗(yàn)分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn) 精密的測(cè)量比較圖譜：相似 相同評(píng)價(jià)結(jié)果：模糊屬性 求索細(xì)枝末節(jié) 分析比較的結(jié)果：對(duì)差異性或一致性作出評(píng)價(jià)2.中藥指紋圖譜的分類：狹義：中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜廣義： 中藥材（原料藥材）指紋圖譜應(yīng)用對(duì)象 中藥原料藥（包括飲片、配伍顆粒）指紋圖譜 中藥制劑指紋圖譜 中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜 最主要、常用 中藥HPLC指紋測(cè)定手段 中藥生物指紋圖譜3. 中藥指紋圖譜研究的目的及意義：目的：（1）對(duì)中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高（2）控制中間體、成品的一致性，減少批間差異意義： 中藥現(xiàn)代化 表征中藥有效物質(zhì)的整體性和復(fù)雜性 推動(dòng)中藥新藥研究開發(fā)和傳統(tǒng)產(chǎn)品的二次開發(fā)

15、4.中藥指紋圖譜建立的原則：系統(tǒng)化學(xué)成分研究和相同的藥理學(xué)研究為依托系統(tǒng)性：應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部 如：中藥人參 皂苷類成分 銀杏葉 黃酮類和銀杏內(nèi)酯類特征性：化學(xué)成分信息具有高度選擇性，區(qū)分中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，成為“化學(xué)條碼” 如：五味子 已知木脂素 未知木脂素 成分之間的順序、比值重現(xiàn)性：在規(guī)定的方法和條件下，不同操作者和不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能做出指紋圖譜二.中藥指紋圖譜的建立1.指紋圖譜測(cè)定方法的選定色譜法：TLC、HPLC、GC、CE光譜法：UV、IR、NIR其他方法：X射線衍射法、NMR及聯(lián)用技術(shù)等HPLC法最常用，具有如下特點(diǎn)： 分離效能高 選擇性高 檢測(cè)靈

16、敏度高 分析速度快 應(yīng)用范圍廣HPLC指紋圖譜測(cè)定方法的選定研究對(duì)象的確定及預(yù)處理 文獻(xiàn)調(diào)研，確定分析檢測(cè)目標(biāo) 例如：黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效成分 黃芪多糖注射液 多糖 原藥材 黃酮、皂苷及多糖 復(fù)方：君臣佐使 供試品的制備 例如：黃芪 黃酮 堿水萃取 皂苷 大孔樹脂吸附 除雜，避免干擾或?qū)ιV柱的損耗色譜條件選擇 最重要、關(guān)鍵性 流動(dòng)相：對(duì)樣品有一定溶解度、適用于使用的監(jiān)測(cè)器、化學(xué)惰性好、低黏度、低沸點(diǎn) 純度高、安全、毒性低、環(huán)境友好 改性劑、助溶劑（異丙醇、四氫呋喃、氯仿） 、梯度洗脫 檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、色譜柱、進(jìn)樣量、檢測(cè)器黃酮類、酚酸類 乙腈水酸系統(tǒng)皂苷類 乙腈水系統(tǒng)生物堿類 乙腈

17、三乙胺系統(tǒng)2.色譜條件的優(yōu)化及規(guī)范化 (1) 樣品中所有組分能被檢出或檢出組分?jǐn)?shù)目盡可能多 (2) 各組分達(dá)到滿意的分離度 (3) 分析時(shí)間短優(yōu)化：流動(dòng)相組成、濃度、值、添加劑規(guī)范化：色譜柱、試劑、儀器操作參數(shù)固定，可重現(xiàn)3.指紋圖譜的信息化和知識(shí)化指紋圖譜信息化指紋圖譜知識(shí)化4.指紋圖譜的建立與辨認(rèn)三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用1.丹參藥材指紋圖譜研究 有效成分： 水溶性 丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素丙、丹參酸乙、丹酚酸A、丹酚酸 B、迷迭香酸、丹參酸 A、3,4-二羥基桂皮酸、-谷甾醇-葡萄糖苷、異阿魏酸、原紫草素、紫草酸 脂溶性成分 丹參酮類 （丹參酮A）(1) 供試品的制備 水提取酸化乙

18、酸乙酯萃取檢測(cè) 方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好(2) 參照物的制備 主成分：原兒茶醛作參照物檢測(cè)方法 流動(dòng)相的選擇 甲醇-0.1%冰乙酸（5:95） 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm 穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 3.0% 重現(xiàn)性試驗(yàn) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 3.0% (4) 丹參原藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)： 填充劑 ODS 流動(dòng)相 甲醇-0.1% (5:95) 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm 柱溫 室溫 流速 1.0 mL/min 參照物溶液的制備 精密稱取對(duì)照品 2.0 mg，5mL定容 供試品溶液的制備 藥材粉碎過篩加熱回流濾液酸化乙酸乙酯萃取殘?jiān)状既芙?測(cè)定法 進(jìn)樣量 10L 記錄1h danshensuprotocatechuic acidprotocatechuic aldehydratecaffeic acidrosmarinic acidlithospermic acidsalv