1、免疫印跡技術(shù)分析樹舌多糖GF對H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表達的影響【摘要】目的探明樹舌多糖GAPSGF對H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表達的影響。方法昆明種小鼠隨機分為兩組：腫瘤組和樹舌多糖組，接種后各組肌肉注射給藥，分別給與生理鹽水和樹舌多糖GF。連續(xù)10d，于末次給藥24h，處死小鼠，剝離腫瘤組織。esternblt技術(shù)檢測各組樣品PTEN蛋白的表達量。結(jié)果腫瘤組檢測結(jié)果為陰性，樹舌多糖組檢測結(jié)果為陽性。結(jié)論樹舌多糖GF抗腫瘤的作用靶點之一可能為抑癌基因PTEN?！娟P(guān)鍵詞】樹舌多糖GF；H22肝癌移植瘤；PTEN蛋白StudyntheEffetsfGAPSGFntheExpressinfP

2、TENinTransplantatinTurfHepataH22byesternBltTehnlgyAbstrat：bjetiveTinvestigatetheinfluenefganderaapplanatuplysaharidesGAPSGFntheexpressinfPTENprtEinintransplantatinturfhepataH22.ethdsiefKuningstraineredividedrandlyinttgrups:turgrupandGAPSgrup.AlltheieereinulatedithhepataH22,thenereinjetedithnralsalin

3、eandGAPSGFrespetivelyfr10days.Afterthelasttiefinjetin,alltheieerekilledanderepeeledfftheturtissueandbservedtheexpressinfPTENprteinbyesternblt.ResultsTheresultfturgrupasnegative,hereastheresultfGAPSGFgrupaspsitive.nlusinneftheanti-turatintargetfGAPSGFaybetheantingenePTEN.Keyrds：GAPSGF；Transplantatint

4、urfhepataH22；PTENprteins樹舌Ganderalipsiense，又稱“老牛肝“扁芝或“扁木靈芝，是一種大型擔(dān)子菌，其性平，味微苦，臨床多用于治療乙型肝炎、食道癌、神經(jīng)衰弱和肺結(jié)核等病癥。樹舌多糖GF是從樹舌中提取的一個組分，有明顯抗腫瘤的作用，能顯著抑制H22肝癌移植瘤p53基因1，N-Ras基因2的表達和進步p163，Rb4的表達量。本研究采用esternblt技術(shù)研究樹舌多糖GF對H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表達的影響，旨在為樹舌多糖GF尋找新的分子靶點，為其作為抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用提供更為充分的理論根據(jù)。1材料與方法1.3方法1.3.1造模與給藥雌雄各半的昆明種小鼠

5、20只，隨機分為2組，每組10只：分別為腫瘤組和樹舌多糖組。選擇710d生長良好的瘤株，無菌取腹水，用生理鹽水13稀釋至2.0106個/l，0.2%臺盼藍染色，計活細(xì)胞數(shù)大于95%，以0.2l/只接種于小鼠右側(cè)腋窩下。接種6h后，各組肌肉注射給藥0.1l/只。樹舌多糖組按50g/kg/d給藥，腫瘤組小鼠給與生理鹽水，連續(xù)10d。1.3.2可溶性蛋白的提取于末次給藥24h，處死小鼠，剝離腫瘤組織，置于冰冷的研缽中，加適量液氮研磨。然后置于3倍體積細(xì)胞裂解液中，用玻璃勻漿器進展勻漿。在勻漿液中參加20g/lDNase和5g/lRNaseA，4作用15in，再振蕩混勻5in，然后4，25000g離心

6、45in，小心避開外表的脂質(zhì)層取上清液，即為蛋白提取物。lry法測定蛋白質(zhì)濃度，-75保存。各組樣品等量混合，即為esternblt所用樣品。2結(jié)果esternblt法檢測PTEN的結(jié)果見圖1。圖中泳道1為蛋白分子量arker，泳道2為腫瘤組樣品，泳道3為樹舌多糖組樣品。從圖中可以看出，腫瘤組樣品esternblt的結(jié)果為陰性，而樹舌多糖組樣品的染色結(jié)果為陽性PTEN蛋白的分子量為47KD。1arker2腫瘤組3樹舌多糖組圖1esternblt法檢測PTEN略3討論PTEN是繼p53之后又一明星抑癌基因，具有雙專一磷酸酶活性，在酪氨酸磷酸酶和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程中具有重要的作

7、用,可以通過特異性地抑制三磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)依賴的蛋白激酶B(PKB或AKT)的激活5，催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)與PIP3脫磷酸,借此調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動的。已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)PTEN的突變或缺失。其抑制腫瘤生長的主要作用表如今：可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯抑制細(xì)胞周期進展和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用來抑制細(xì)胞生長；PTEN的雙特異性磷酸酶(DSP)可通過參與整合蛋白所激發(fā)的跨膜信號傳導(dǎo)和下調(diào)聚集黏附的黏著斑激酶(FAK)磷酸化程度,而抑制細(xì)胞的趨化、遷移、鋪展、聚集和黏附6，7；主要通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成而調(diào)節(jié)未分化和已分化細(xì)胞的體積8，調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞的細(xì)胞增殖9；PTEN下調(diào)血管內(nèi)皮生

8、長因子(VEGF)RNA的程度，可以影響其分泌，從而調(diào)控血管生長10，進而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。PTENDNA的5端的非翻譯區(qū)中有多個G重復(fù)序列，為甲基化提供了調(diào)節(jié)可能。高甲基化使PTEN基因處于靜止態(tài),造成PTEN的低程度轉(zhuǎn)錄或PTEN蛋白的缺失11，從而消除了PTEN對一些腫瘤細(xì)胞系生長的抑制才能。本研究esternblt的結(jié)果顯示，腫瘤組樣品結(jié)果為陰性，而樹舌多糖組樣品的染色結(jié)果為陽性。這說明，PTEN蛋白在小鼠H22肝癌移植瘤中表達量大幅度降低，或發(fā)生基因的缺失，應(yīng)用esternblt法檢測不到它的表達；樹舌多糖GF可以誘導(dǎo)H22肝癌移植瘤PTEN的表達或阻止其缺失，故而應(yīng)用esternblt法可以檢測到它的表達。而小鼠H22肝癌移植瘤PTEN基因的表達產(chǎn)物明顯減少很可能是由于腫瘤細(xì)胞PTEN