第九章（4）凋亡與腫瘤“我們已經(jīng)知道，作為抑癌基因，P53影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制包括在DNA損傷后阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程并參與修復(fù)，在機(jī)體面對不利因素的情況下介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，直到現(xiàn)在為止，我們對凋亡的認(rèn)識并不完全，也未能完全公平評判自殺程序在腫瘤病因?qū)W中的作用?，F(xiàn)在，我們重新回顧一下凋亡，并展開更深層次的探討。”1、凋亡過程依賴線粒體

1972年之前，多細(xì)胞動物組織里的細(xì)胞通常被認(rèn)為是因壞死而被單個(gè)消滅的；20世紀(jì)80年代晚期，對線蟲發(fā)育的遺傳學(xué)研究擬示了凋亡在這些微小動物的正常發(fā)育過程中參與清除各種細(xì)胞。大家逐漸認(rèn)識到，對于所有的多細(xì)胞生物而言，凋亡都是一個(gè)基本的生物學(xué)行為。表9-4-1：凋亡與壞死的區(qū)別線粒體在凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞色素c是這個(gè)過程的核心因素，通常位于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的間隙，作為氧化磷酸化作用的一部分，起傳遞電子的作用。然而，一旦某些信號起始凋亡，線粒體的外膜開啟通道，細(xì)胞色素c就會脫離線粒體，進(jìn)入外圍胞質(zhì)，聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)引起導(dǎo)致凋亡的級聯(lián)事件。所以，在真核細(xì)胞進(jìn)化的過程中，在細(xì)胞產(chǎn)生大量能量的地方同時(shí)還存在養(yǎng)另一完全不相關(guān)的功能，那就是產(chǎn)生和釋放生化信號，誘導(dǎo)相關(guān)變化最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。圖9-4-1：細(xì)胞色素c從線粒體中釋放入細(xì)胞質(zhì)：（A)

起始時(shí)，細(xì)胞色素c與線粒體在細(xì)胞質(zhì)中的分布一致；(B)(C)(D)當(dāng)?shù)蛲鲋饾u進(jìn)展，細(xì)胞色素c逐漸從線粒體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，它在細(xì)胞漿中的染色體變得越來越均勻一致，同時(shí)細(xì)胞核表示出與凋亡相一致的斷裂細(xì)胞色素c可被特異性熒光標(biāo)記抗體檢測（綠色），與染料標(biāo)記細(xì)胞核（紅橙色）區(qū)別Bcl-2蛋白是一個(gè)大而復(fù)雜的家族中的一員，它能調(diào)控細(xì)胞色素c通過線粒體外膜上的特異性通道釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這些通道也特異性地決定細(xì)胞色素c和其他的蛋白質(zhì)是否從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)。Bcl-2家族的一些成員，如Bcl-2和bcl-XL，能夠保持這些通道關(guān)閉；而其他Bcl-2相關(guān)蛋白，如Bax、Bad、Bak和Bid，起開啟這些通道的作用。圖9-4-2：Bcl-2和相關(guān)蛋白：Bcl家族成員既有抑制凋亡的作用又有促進(jìn)凋亡的作用。這些蛋白質(zhì)都具有一個(gè)同樣的BH3結(jié)構(gòu)域（紫色），有些如Bcl-2還具有BH1和BH2結(jié)構(gòu)域

（紅色，藍(lán)綠色），一些成員還具有用于鈾定于細(xì)胞膜上的跨膜結(jié)構(gòu)域（淺綠色）和BH4結(jié)構(gòu)域（深綠色），具有BH4結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以在一定程度上抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，進(jìn)而具有抑制凋亡的功能。促凋亡蛋白可以分為Bax家族和只含有BH3結(jié)構(gòu)域家族蛋白。Bax家族蛋白以無活性形式，存在于線粒體外膜或者細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，無活性的只含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)只存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，兩類促亡蛋白在凋亡信號的刺激下被活化（或者），轉(zhuǎn)位到線粒體外膜。人類基因組已知能編碼24種Bcl-2相關(guān)蛋白。它們中的6種是抗凋亡蛋白，剩下的18種是促凋亡蛋白。每一個(gè)通道內(nèi)的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相對水平?jīng)Q定細(xì)胞色素c是保留在線粒體內(nèi)還是釋放出來，從這個(gè)角度來說，線粒體膜通道決定細(xì)胞的生存或死亡。這也可以解釋為，組織中不同細(xì)胞的命運(yùn)由促凋亡和抗凋亡

Bcl-2樣蛋白之間的精密平衡來掌控。圖9-4-3：凋亡前體蛋白和抗凋亡蛋白之間的精密平衡：(A)

野生型小鼠的腎臟在5周齡時(shí)結(jié)構(gòu)完整；(B)

抗凋亡bcl-2基因的雙生殖系拷貝缺失（造成bcl-2-/-表型）導(dǎo)致這個(gè)年齡小鼠廣泛性的細(xì)胞凋亡和多囊性腎?。?C)如果凋亡前體bim基因的單生殖系拷貝缺失可避免這種情況的出現(xiàn)（高產(chǎn)bcl-2-/-bim+/-表型）Bcl-2蛋白家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的作用各不相同，每個(gè)成員都有自己的反向作用伴隨者。圖9-4-4：Bcl-2蛋白家族的每一個(gè)成員都有自己的一套反向作用劑此外，這些蛋白質(zhì)都可以誘導(dǎo)特定細(xì)胞類型中的細(xì)胞凋亡。例如，Bim在控制乳腺的發(fā)展中起到了關(guān)鍵性的作用，使管腔形成了管道。細(xì)胞色素c一旦從線粒體逃逸至細(xì)胞質(zhì)，它就與Apaf-1蛋白形成一個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，稱為凋亡小體。形成的這個(gè)凋亡小體復(fù)合物活化潛在的細(xì)胞質(zhì)蛋白酶前體caspase9（半胱天冬酶9），使之變成活化的caspase9。小體活化的caspase9剪切前體caspase3活化另一相關(guān)的蛋白酶，接著再切割并活化其他前體caspase,

形成條鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這種剪切的順序相連形成一種信號級聯(lián)放大。當(dāng)胞質(zhì)的細(xì)胞色素c活化caspase時(shí)，另一個(gè)與細(xì)胞色素c一同從線粒體釋放出來的蛋白質(zhì)Smac/DIA-BLO可以失活一組稱為IAP（inhibitorofapoptosis）的抗凋亡蛋白。正常情況下，lAP以下面兩種方式抑制caspase

的活性：直接結(jié)合和標(biāo)記在泛素化caspase上并把它降解。如果沒有IAP持續(xù)抑制的影響，caspase可以自由地起始蛋白酶水解切割，最終導(dǎo)致凋亡。所以，在線粒體膜通道開放以后，凋亡信號以兩種方式活化。細(xì)胞色素c釋放并活化凋亡小體內(nèi)的caspase9。同時(shí)，從通道內(nèi)釋放出來的Smac/DIABLO失活I(lǐng)AP,

從而使caspase免除IAP的抑制。caspase的級聯(lián)活化將會一直進(jìn)行，直到最終導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡。圖9-4-5：Bcl-2樣蛋白的多樣性是各種各樣的細(xì)胞生理刺激通過不同的凋亡前體蛋白去對抗抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-XL（綠色），因此阻止Bcl-XL蛋白中和Bax及Bak（淺棕色），它們是一個(gè)重要的凋亡前體蛋白，能從線粒體膜釋放細(xì)胞色素c。在凋亡通路下游已激活的caspase也可以通過蛋白質(zhì)水解（切割tBid）激活Bid促凋亡功能，從而放大凋亡反應(yīng)caspase從功能上分為兩類：一類為起始性的caspase，它們是真正的破壞細(xì)胞重要組分的實(shí)施者。一類為下游執(zhí)行caspase，掌控了破壞細(xì)胞關(guān)鍵組分的工作。一系列重要的細(xì)胞組分都被死亡執(zhí)行性的caspase,

如caspase3

、caspase6

和caspase7剪切。它們的剪切降解引起細(xì)胞復(fù)雜的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)化，這些轉(zhuǎn)化伴隨著細(xì)胞凋亡而進(jìn)行。核膜內(nèi)表面的核纖層蛋白的切割，即和可觀測到代表凋亡的染色質(zhì)凝集和核皺縮（固縮）同時(shí)進(jìn)行。剪切半胱天冬酶活化的脫氧核糖核酸酶的抑制劑（ICAD）能使脫氧核糖核酸酶活化，從而降解染色體

DNA。剪切細(xì)胞骨架蛋白，如肌動蛋白、網(wǎng)格蛋白、彈性蛋白和（肌動蛋白）凝溶膠蛋白，能使細(xì)胞骨架塌陷，質(zhì)膜外生性地水泡狀生長，形成

“自然死亡”小體。caspase

對它的降解能破壞電子傳遞鏈，使ATP產(chǎn)生失敗，從線粒體中釋放活性氧，使線粒體的結(jié)構(gòu)也失去整體性，從而擴(kuò)增凋亡程序。凋亡多個(gè)步驟的有效實(shí)施在一定程度上又進(jìn)一步地增強(qiáng)了凋亡起始信號。圖9-4-6：凋亡的半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)：線粒體外膜

（暗褐色）有著決定細(xì)胞生存或死亡的關(guān)鍵性的門控通道。抗凋亡信號控制線粒體外膜通道的關(guān)閉，凋亡前體蛋白則使之開啟。釋

放入細(xì)胞質(zhì)的重要線粒體分子是細(xì)胞色素c分子（紅球）和

Smac/DIABLO

分子（褐方）。細(xì)胞色素c聚集Apaf-1形成一個(gè)7輻條的輪狀凋亡小體（左）。凋亡小體能轉(zhuǎn)換活化前體

caspase9成有活性的caspase9（綠環(huán)），caspase9繼續(xù)剪切并活化前體caspase3

、caspase6

和caspase7

，轉(zhuǎn)換成死亡決定性的caspase,

然后就可以剪切各種底物，產(chǎn)生凋亡表型。正常情況下，許多凋亡抑制物（IAP）結(jié)合并失活caspase。然而，同時(shí)從線粒體釋放出來的Smac/DIABLO能對抗這些IAP，從而使caspase免除IAP的抑制2、細(xì)胞內(nèi)外途徑均可介導(dǎo)凋亡前面所述的凋亡程序能在許多信號，如：重要的基因組損傷、缺氧，以及那些細(xì)胞內(nèi)部生長調(diào)節(jié)信號的不平衡的刺激下使p53活化處于凋亡誘導(dǎo)狀態(tài)，后者推動如Bax這樣的蛋白能開啟線粒體膜通道，細(xì)胞色素c和其他凋亡前體蛋白就能從線粒體釋放出來，活化caspase,起始凋亡。這一系列的事件有時(shí)稱為細(xì)胞凋亡的內(nèi)途徑，因?yàn)槠鹗夹盘杹碜约?xì)胞內(nèi)部。凋亡也可以通過其他選擇性的途徑起始。其中之一就是細(xì)胞外信號活化凋亡前體細(xì)胞的表面受體。細(xì)胞表面受體是跨膜蛋白，通常被稱為死亡受體，提示它們具有活化凋亡程序的能力。在結(jié)合了細(xì)胞外間隙的相應(yīng)配體后，死亡受體能活化細(xì)胞質(zhì)中的半胱天冬酸級聯(lián)反應(yīng)

，最終和前面所述的內(nèi)源性凋亡通路會聚，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，這種受體所引起的凋亡稱為外源性凋亡程序或受體活化凋亡途徑。表9-4-2：死亡受體和它們的配體圖9-4-7：不同類型哺乳動物細(xì)胞表面有5個(gè)不同死亡受體家族死亡受體的配體是腫瘤壞死因子

(TNF)

家族成員，包括TNF-a、TRAIL和Fas死亡受體的配體（FasL）。每個(gè)TNF樣蛋白與它們的相應(yīng)受體結(jié)合，這個(gè)受體家族的許多成員之中大約有30個(gè)由人類基因組編碼，有一個(gè)共同的胞漿死亡結(jié)構(gòu)域。這些受體和它們的行為因?yàn)槭荏w和配體名稱的多樣性而變得復(fù)雜，一旦被配體的結(jié)合所活化，這些受體的死亡結(jié)構(gòu)域能結(jié)合并活化細(xì)胞質(zhì)中稱為FADD的蛋白質(zhì)。形成的復(fù)合物稱為DISC，能聚非活化的、酶原形式的caspase8,

少數(shù)情況下是

caspase10,

它們都是起始性的caspase。caspase8

和

caspase10活化執(zhí)行死亡的caspase3

、caspase6

和caspae7,

最后和內(nèi)途徑凋亡程序殊途同歸。圖9-4-8：凋亡內(nèi)途徑與外途徑匯聚：在死亡受體把前體caspase8和（或）caspase10活化成相應(yīng)的caspase后，后者通過切割和活化執(zhí)行caspase和內(nèi)源性凋亡級聯(lián)反應(yīng)的匯聚實(shí)際上，還存在著凋亡的第三條途徑，此途徑由殺傷靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞起始。這兩種殺傷細(xì)胞能夠活化靶細(xì)胞表面表達(dá)的死亡受體，如Fas。另外，殺傷性細(xì)胞能結(jié)合在靶細(xì)胞表面，并注入一種被稱為顆粒酶B的蛋白，顆粒酶一旦受制于這些殺傷細(xì)胞，就能切割并活化酶原caspase3和caspase8，和前面所描述的途徑相匯聚，繼續(xù)作用而引起凋亡。3、癌細(xì)胞抵抗凋亡細(xì)胞在形成腫瘤的漫長過程中會遇到許多生理應(yīng)激因子威脅它們的存在，每個(gè)生理應(yīng)激因子都能誘導(dǎo)凋亡。事實(shí)上，所有的癌細(xì)胞都有抗凋亡的戰(zhàn)略機(jī)制。小部分人類腫瘤過表達(dá)

Mdm2，這些影響ARF或Mdm2表達(dá)的機(jī)制都會降低細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的水平。最終，在許多人類腫瘤細(xì)胞中，p53就會錯(cuò)誤定位，沉默于細(xì)胞質(zhì)中。另外一個(gè)對抗凋亡高度有效的機(jī)制來自PI3K-Akt/PKB通路的過度活化。這條通路的活化來自酪氨酸激酶受體和Ras癌蛋白的聯(lián)合作用，它們都能活化Pl3K使PIP3的水平升高，活化Akt/PKB。一旦Akt/PKB被聚集的PIP3活化，它就能磷酸化并抑制促凋亡蛋白，同時(shí)磷酸化并活化Mdm2。另一個(gè)逃避凋亡的機(jī)制在兒童成神經(jīng)細(xì)胞瘤中表現(xiàn)得很明顯，N-myc基因的擴(kuò)增表明了腫瘤的攻擊性生長和預(yù)期壽命的縮短。對于它本身來說，這種擴(kuò)增確實(shí)威脅到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，如前由所述，myc癌基因的行為是一把雙刃劍。這些編碼癌蛋白的基因釋放潛在的有絲分裂信號，但同時(shí)又強(qiáng)烈地促凋亡。許多神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞通過基因擴(kuò)增過表達(dá)N-myc，看起來解決了這個(gè)問題，至少一部分通過甲基化或缺失失活caspase8

編碼基因。外途徑細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)通路常與癌細(xì)胞發(fā)展相關(guān)。事實(shí)證明在有些腫瘤細(xì)胞中，此通路常是失活的。有些癌細(xì)胞表達(dá)FLIP(FLICE-抑制蛋白），一種通過結(jié)合死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域而介導(dǎo)外源性途徑凋亡級聯(lián)反應(yīng)活化的蛋白質(zhì)，從而阻斷這個(gè)反應(yīng)過程和阻止起始caspase8的自我催化活化。其他腫瘤細(xì)胞通過甲基