第十二章（3）DNA修復缺陷引發(fā)的疾病前言：介紹完DNA損傷的來源、預防和修復，今天我們主要來學習幾個DNA損傷修復缺陷引發(fā)的疾病。DNA損傷修復缺陷引發(fā)的疾病著色性干皮病（XP）1874年，兩名澳裔匈牙利內(nèi)科醫(yī)生FerdinandHebra和MoritzKaposi,描述了一種與皮膚鱗狀細胞的和基底細胞癌高頻發(fā)生相關(guān)的罕見綜合征，Kaposi隨后以其名字命名了這種獨特的肉瘤。隨著研究越來越清楚，發(fā)現(xiàn)感染個體對UV射線極其敏感，僅僅是很少量的陽光照射后就會使嬰兒的皮膚受到嚴重的灼傷。這些個體出現(xiàn)干燥的羊皮紙樣皮膚（著色性干皮?。┖驮S多雀斑。圖1：著色性干皮病患者總的來說，年齡低于20歲的著色性干皮病(XP)患者比一般人患皮膚癌的風險高出2000倍，患舌尖鱗狀細胞癌的風險高100000倍。著色性干皮病兒童患皮膚癌的平均年齡約為10歲，而正常人群患皮膚癌的年齡一般約為60歲。XP患者患其他疾病的風險也會升高，特別是神經(jīng)系統(tǒng)疾病。圖2：著色性干皮病的流行病學現(xiàn)在知道有8個基因與XP相關(guān)，其8個XP相關(guān)基因中的7個，被命名為XPA~XPG,編碼大的多蛋白核苷酸切除修復復合體(NER)的組分。第八個基因XPV為錯誤傾向DNA聚合酶η（pol-η)

。當細胞常用的DNA聚合酶（如DNA聚合酶δ)不能復制未經(jīng)修復的DNA損傷（如嘧啶二聚體）時，就會動用DNA聚合酶η。錯誤傾向聚合酶（有時被稱為旁路聚合酶）能夠復制包含仍未修復的T-T二聚體的DNA模板鏈，一般在互補鏈合成兩個A。pol-η通常被認為是很準確的，95%的時間它可將AA核苷酸摻入到與TT相對的延伸鏈。Cockayne綜合征其他一些遺傳綜合征也與NER的缺陷有關(guān)，如Cockayne綜合征(CS)患者體內(nèi)與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的NER相關(guān)的兩個基因中一個有缺陷，他們的細胞具有與XP患者細胞相似的高光敏感性，死于該疾病的患者中位年齡是12歲。這種疾病非常罕見，因為顯著的DNA修復損傷并沒有表現(xiàn)出明顯的腫瘤發(fā)病率升高。迄今尚未明確XP或Cockayne綜合征相關(guān)突變等位基因為雜合型的個體患某種特定類型癌癥的風險是否會升高。遺傳性非息肉性結(jié)腸癌（HNPCC）遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC)是一種家族性癌癥綜合征，代表了遺傳性易感體質(zhì)患結(jié)腸癌的普遍原因，占所有結(jié)腸癌的2%~3%。正如其名，HNPCC不同于我們前面提到的另一種類型的遺傳性結(jié)腸癌易感類型——結(jié)腸腺瘤狀。HNPCC患者的一種亞類在其80%的生命中都有患結(jié)腸癌的風險，除此之外，他們對腦腫瘤、子宮內(nèi)膜瘤、胃癌、卵巢癌和泌尿系統(tǒng)癌癥的易感性也會升高。HNPCC患者的高癌癥易感性可以追溯到其結(jié)腸中腫瘤進展速率的增加：腺瘤到腺癌在普通人群中的進展過程需要8~10年,而HNPCC患者由于細胞的遺傳不穩(wěn)定性會使這一進程縮短至2~3年。絕大多數(shù)（85%~90%)HNPCC是由編碼兩種重要錯配修復蛋白MSH2和MLH1的基因發(fā)生胚系突變所引起的，另兩個MMR基因MSH6和PMS2的胚系突變只參與小部分（約15%)HNPCC的發(fā)生。但是，另兩個在DNA修復中同樣起重要作用的MMR相關(guān)基因(PMS1、MSH3)卻極少發(fā)生胚系突變。與很多抑癌基因的遺傳學特點相同，患者僅遺傳一個有缺陷的MMR等位基因，這樣的患者發(fā)生癌癥時幾乎所有的腫瘤細胞總是發(fā)生雜合性丟失(LOH),使MMR基因的活性野生型拷貝丟失。細胞失去發(fā)現(xiàn)和修復序列錯配的能力將導致含有微衛(wèi)星重復序列基因的突變率增加。關(guān)于這種修復缺陷的后果，一個早期的典型例子是對11個存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌細胞系的研究。在這11個細胞系中，有9個存在II型TGF-β受體編碼基因的突變。特別是該基因的野生型閱讀框中有10個腺嘌呤(A)核苷酸序列的延伸。然而在這9個細胞系中，TGF-βRII基因丟失了十腺嘌呤核酸序列聚合體中的一個或兩個。這種改變使TGF-βRII基因的編碼序列改變了閱讀框，生成沒有功能的TGFβRII蛋白?？梢韵胂?，一旦腫瘤細胞前體不再表達TGF-βRII,它們將逃避抗分裂原因子(TGF)的生長抑制作用。圖3：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性影響TGF-β受體基因幾乎在這些所有的腫瘤中，微衛(wèi)星不穩(wěn)定的現(xiàn)象大多歸因于甲基化導致的MLH1基因沉默。有趣的是，在與MMR缺陷腫瘤鄰近的正常子宮內(nèi)膜組織中，MLH1基因常被甲基化，表明甲基化是這一組織中腫瘤進展的早期事件之一。MLH1和MLH2表達缺乏的細胞除了喪失錯配修復功能之外，還表現(xiàn)出對在正常情況下激活G2/M檢測點或誘導細胞凋亡的烷基化誘變劑的抗性。這種細胞在暴露于DNA損傷劑后仍然可以連續(xù)通過G2/M期從而逃避凋亡，在發(fā)生特定DNA損傷后，細胞還可產(chǎn)生MSH2突變，從而使MMR功能選擇性地失活，而不影響其啟動凋亡的能力。先天性乳腺癌和卵巢癌易感性到目前為止，最著名腫瘤相關(guān)基因是BRCA1和BRCA2。這兩個基因中的任何一個發(fā)生胚系等位基因突變都會導致先天性的乳腺癌和卵巢癌易感性。此外，BRCA2胚系突變的男性攜帶者在65歲前發(fā)生前列腺癌的風險將增加7倍以上。在這兩個基因第一次被發(fā)現(xiàn)時，由于其參與細胞增殖、生長和分化的動態(tài)調(diào)節(jié)，人們認為應該將之歸于抑癌基因。但是越來越多的證據(jù)表明，這兩個基因?qū)嶋H上參與維持基因組的完整性，應該歸入“看守基因"(DNA修復蛋白）的行列，而非“門衛(wèi)基因”（腫瘤抑制蛋白）。現(xiàn)在看來，這種劃分過于簡單化，隨著BRCA1和BRCA2蛋白功能的逐步揭示，它們顯示出更為廣泛的核功能。研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1和BRCA2蛋白在核內(nèi)形成復合體，并與許多其他蛋白相互作用。這個大的復合體含有RAD50/Mre11和RAD51蛋白——與酵母中兩個在電離輻射（如X射線）引起的DNA斷裂修復中起重要作用的蛋白同源。同時，在該復合體中也發(fā)現(xiàn)了錯配修復蛋白。用能導致S期復制叉停滯的脛基脲處理細胞，可使BRCA1分子在細胞核中的復制叉部位聚集。許多這些停滯的復制叉被認為是雙鏈DNA的斷裂位點，這種斷裂是復制叉處尚未復制的單鏈意外斷裂引起的,產(chǎn)生的斷裂通常通過同源重組修復(HR)或同源介導修復(HDR)機制修復。免疫熒光分析結(jié)果顯示，BRCA1分子正常情況下以大量小點的形式分布于整個細胞核，脛基脲使BRCA1分子聚集為少數(shù)的幾個大的離散點，其中含有定位于復制叉的增殖細胞核抗原(PCNA)。這些點還含有其他一些已知的DNA修復蛋白，包括Rad50和Rad51。BRCA2蛋白也在這些點中為其參與DNA修復過程提供了證據(jù)。而且，當用窄激光束有目的地使細胞核中不同區(qū)域出現(xiàn)雙鏈DNA斷裂時，發(fā)現(xiàn)BRCA1蛋白與γ-H2AX共定位于該區(qū)域。γ-H2AX是一個磷酸化的組蛋白，出現(xiàn)在雙鏈DNA損傷的染色質(zhì)側(cè)翼位點。參與DNA修復的共20種不同的蛋白質(zhì)也被募集到損傷區(qū)域，并且蛋白數(shù)目還在增加。圖4：BRCA1及其DNA損傷的反應上圖中，BRCA1蛋白（用熒光標記的抗體檢測）通常分布于S期細胞核內(nèi)大量離散小點的位置（綠色，第一幅圖）。但是，當用羥基脲處理S期細胞的時候，復制叉停止，BRCA1蛋白脫離這些小點，聚集為少數(shù)的幾個大點（綠色，第二幅圖）?？捎^察到增殖細胞核抗原(PCNA)也有相似的重新定位模式，已知該蛋白與復制叉相關(guān)（紅色，第三幅圖）。黃色點表示BRCA1與PCNA共定位（第四幅圖）。這些停滯的復制叉往往是復制叉處尚未復制的單鏈DNA(因而很脆弱）偶然斷裂造成的雙鏈DNA斷裂位點。這些結(jié)果表明，BRCA1被募集到了雙鏈DNA斷裂的位置。使用抑制劑抑制BRCA1或BRCA2突變細胞的PARP酶活性：參與堿基切除修復(BER)的DNA修復酶被PARP1蛋白［多聚(ADP-核糖）聚合酶］募集于單鏈斷裂位點（SSBsite)。這種酶結(jié)合于斷裂位點并進行自身ADP-核糖基化（可能也使相鄰蛋白糖基化)。然后多聚-ADP尾作為錨定位點募集SSB修復酶，因此當PARP1被抑制時SSB將持續(xù)存在。當復制叉在S期通過斷裂位點時，這些SSB將產(chǎn)生更嚴重的問題——雙鏈斷裂（DSB)。下圖中SSB（金色）通常通過BER被切除，然后由PARP1和招募的修復酶進行修復。但是，在PARP抑制劑存在的情況下，這些修復酶不能被招募，BER不能完成，從而導致在下一個S期復制叉通過時，原來的單鏈斷裂轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈斷裂(DSB)。只有通過同源介導修復(HR)才能將這種斷裂有效地修復為野生型，但在BRCA1和BRCA2突變細胞中，HR存在缺陷。圖5：抗PARP藥物對BRCA2陰性細胞的殺傷機制在遺傳學水平上敲除所有BRCA1功能的小鼠死于胚胎發(fā)育早期，但是僅丟失部分功能的BRCA2胚系突變等位基因造成惡性淋巴瘤的易感性增加和染色體異常，這些異常染色體結(jié)構(gòu)顯示兩個染色體臂之間的非同源重組（或融合）率的增高。該染色體結(jié)構(gòu)是DNA雙鏈斷裂異常修復的特征性結(jié)果，其中許多是由于可能偶然出現(xiàn)在細胞周期S期的復制叉處而造成的。此外，BRCA2缺陷導致中心體數(shù)目及隨后的有絲分裂紡錘體失調(diào)，從而產(chǎn)生非整倍體，而且細胞內(nèi)BRCA2水平降低還會導致有絲分裂后期胞質(zhì)分離的延長。然而，檢測體外培養(yǎng)細胞由X射線引起的DNA雙鏈斷裂中恢復正常DNA能力的實驗提供了其他關(guān)于BRCA1和BRCA2突變細胞內(nèi)雙鏈DNA修復缺陷的證據(jù)。缺乏BRCA1大部分功能的細胞對X射線殺傷的敏感性和對于化療藥物如順鉑的敏感性顯著增加（順鉑可以引起DNA鏈間的共價交聯(lián)）。圖6：BRCA2功能部分缺失引起的核型改變一條染色單體上雙鏈DNA斷裂的修復，通常依賴于修復機器參照姐妹染色單體上未損傷同源序列進行修復的能力，即通過參照仍然完整的DNA片段指導修復裝置重建斷裂的雙螺旋結(jié)構(gòu)。因此，這種同源介導修復(HDR)主要發(fā)生在細胞周期S期的晚期和G2期，這個時期姐妹染色單體的DNA雙螺旋可為修復損傷染色單體提供序列信息。圖7：同源介導修復在BRCA1或BRCA2功能喪失的細胞中，所有類型的同源介導修復(HDR)都存在，RAD51蛋白（可直接與BRCA2相互作用）的行為可能部分地解釋這種現(xiàn)象。RAD51能結(jié)合單鏈DNA分子，使其侵入（并因此解開）同源雙鏈螺旋，該過程是起始HDR必需的。BRCA2有8個BRC結(jié)構(gòu)域，原則上每一個都可以與一個RAD51分子結(jié)合，表明BRCA2可將RAD51分子裝配成線狀，從而與單鏈DNA結(jié)合。如果缺少BRCA1或BRCA2,RAD51可能就不會被募集至雙鏈DNA斷裂位點，隨后，HDR過程也不會正確地進行。在BRCA2突變細胞分裂中期觀察到的三向輻射和四向輻射染色體，就是這些細胞內(nèi)修復裝置不能利用HR修復雙鏈DNA斷裂所導致。圖8：BRCA1、BRCA2及其相互作用分子BRCA1和BRCA2在維持染色體結(jié)構(gòu)正常、避免癌癥發(fā)生中到底如何發(fā)揮作用還不是很清楚。BRCA1和BRCA2可以與多種參與DNA修復核蛋白結(jié)合的事實說明，它們至少可部分地作為分子支架募集其他蛋白復合物。一旦完成聚集，這些修復蛋白就會協(xié)同作用，修復DNA上的損傷和大片段雙鏈斷裂。而且，BRCA1缺失可以破壞某些正常情況下對DNA損傷做出反應的細胞周期檢驗點調(diào)控。圖9：BRCA1的作用Nijmegen斷裂綜合征Nijmegen斷裂綜合征患者也存在同源介導修復缺陷。他們的細胞缺乏Nbsl蛋白質(zhì),無法起始HDR。由于不能進行HR,這些患者的細胞轉(zhuǎn)而通過非同源末端連接(NHEJ)使兩個雙鏈DNA的末端發(fā)生融合。重建的DNA雙螺旋中丟失了原本未損傷DNA雙螺旋中的部分堿基對。圖10：非同源末端連接NHEJ必然是一個錯誤傾向過程，因為在一條染色單體上的野生型DNA序列并不知道其姐妹染色單體上排列有兩條融合的DNA片段，產(chǎn)生的末端－末端融合在連接位點形成突變序列，導致Nijrnegen斷裂綜合征患者患惡性血液病的發(fā)病率較高。NHEJ機器中成員發(fā)生缺陷、同時p53功能缺失的小鼠淋巴瘤的發(fā)生率非常高。有趣的是，NHEJ多發(fā)生在G1期，恰好是姐妹染色單體不能進行同源介導修復的時期。實際上NHEJ在DNA修復過程中的作用是獨一無二的，因為其在與DNA損傷修