關(guān)于植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象和解決途徑第1頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五1.褐化：植物組織培養(yǎng)中所說的褐化(browing)是指在外植體誘導(dǎo)初分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。2.褐化、污染和玻璃化并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困難

第2頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五褐化發(fā)生的形式及褐化發(fā)生機(jī)理影響褐化的因素防止褐化的途徑展望第3頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五褐化發(fā)生的形式及褐化發(fā)生機(jī)理

褐化分為酶促褐化和非酶促褐化。

1.非酶促褐化是由于細(xì)胞受脅迫條件或其它不利條件影響所造成的細(xì)胞死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡而造成的褐化，其中不涉及到酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.酶促褐化是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)的參與而引起的褐化現(xiàn)象。第4頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五酶促褐化必須具備酶、底物和氧三個(gè)條件。

1.酶：多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PLA）等。

2.底物：酚類化合物

3.氧氣第5頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五酚類物質(zhì)的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是都含有帶羥基的苯環(huán)結(jié)構(gòu).按其組成結(jié)構(gòu)可分為:1.苯基羧酸類（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等）、

2.苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等）、

3.黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等）三大類。第6頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五酶和底物的深入研究已經(jīng)為酶促反應(yīng)體系理論的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.Mayer(1979)發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)的含量與其褐變率成正相關(guān)，提出了果實(shí)組織細(xì)胞中酚類物質(zhì)和PPO的區(qū)域化分布假說。

2.鞠志國(guó)(1988)證實(shí)：萊陽梨細(xì)胞中的酚類物質(zhì)集中于液泡，而PPO則主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，并且果實(shí)內(nèi)總酚含量與其褐變密切相關(guān)。

3.羅曉芳等(1999)的研究表明，酚類物質(zhì)的總含量與褐變有一定的關(guān)系，同時(shí)易被褐變的材料的褐變程度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加。第7頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五

影響褐化的因素

1.外植體自身：包括外植體的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)、外植體的遺傳特性等。2.外植體所處的培養(yǎng)環(huán)境：包括培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件的影響。第8頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五一.植物種類及基因型

1.不同物種之間褐化程度差異很大

2.同種植物的不同品種間也存在一定差異橡膠樹的花藥培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)海墾2號(hào)花藥的褐變較少，因而愈傷組織化容易，而有些品系花藥容易褐化，誘導(dǎo)困難；銀杏的眾多品系中佛手品系比梅核品系誘導(dǎo)愈傷織困難。這些可能是由于外植體的基因型差異引起的。第9頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五二.外植體部位、生理狀態(tài)、取材時(shí)期、外植體的大小及受傷程度邱璐等(2000)用桑樹基部發(fā)出的幼芽作外植體比用上部高大枝條的壯枝上的壯芽作外植體褐化輕、褐化率低，幼齡樹比老齡樹褐化輕、褐化率低。

Gannoun等(1995)報(bào)道，阿月渾子2年和4年生材料的組織培養(yǎng)獲得成功，但8年和26年生材料則出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

Wang等(1987)報(bào)道“富士”蘋果和“金華”桃在9月到2月取材褐變輕，5月到8月取材褐變重。可見，外植體的選擇對(duì)對(duì)組織培養(yǎng)的成敗至關(guān)重要。第10頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五三.培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式

1.無機(jī)鹽濃度

過高的無機(jī)鹽濃度會(huì)引起植物外植體的褐化，這在油棕和云桑的組織培養(yǎng)中得到體現(xiàn)。

2.光照

甘蔗胚性細(xì)胞在過強(qiáng)的光照（2500Lx以上）下，細(xì)胞團(tuán)表面容易褐變，弱光下則會(huì)出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。

3.溫度高溫能促進(jìn)酚類氧化,而低溫可以抑制酚類化合物的合成,可以降低多酚氧化酶的活性,減少酚類氧化,從而減輕褐變。

4.抗氧化劑抗氧化劑對(duì)核桃、桑樹和荔枝的組織培養(yǎng)中外植體的褐化程度影響很大。第11頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五

防止褐化的途徑

一.選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w

外植體組織的受傷害程度直接影響褐變的發(fā)生。

Bonga認(rèn)為外植體越小，切面與體積的比率越大，傷害及褐化的程度越大，這在巨桉和卡德蘭的組織培養(yǎng)中得到驗(yàn)證。

Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、葉片作外植體進(jìn)行培養(yǎng)也很少發(fā)生褐變。因此，在切取外植體時(shí)，應(yīng)盡可能減少其傷口面積，傷口剪切盡可能平整些。切取外植體時(shí)還應(yīng)考慮其粗度，細(xì)的可切短些，粗的可切長(zhǎng)些。

第12頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五二.對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理

預(yù)處理包括：流水沖洗、低溫消毒、接種前用無菌水沖洗等。對(duì)易褐變的材料經(jīng)流水沖洗后放在2-50C的低溫下處理12-24h，經(jīng)消毒處理后接種到只含有蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7d，一方面使外植體中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基，另一方面使外植體傷口愈合，這樣可使外植體褐化程度減輕。第13頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五三.選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組培中外植體的褐化是植物在一種逆境下的適應(yīng)性反應(yīng)，因此,在最適宜的培養(yǎng)條件下,外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài),有較強(qiáng)的分生能力,便可大大減輕褐化?？ǖ绿m開始培養(yǎng)時(shí)，溫度保持在15-200C，培養(yǎng)基PH調(diào)節(jié)至5.5有助于減輕褐化的程度。第14頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五四.添加褐變抑制劑和吸附劑

1.褐變抑制劑：包括抗氧化劑和PPO的抑制劑。水解乳蛋白，硫脲、二氨基二硫代甲酸鈉、氯化鈉是PPO的抑制劑。

2.吸附劑：a.可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑

b.活性炭是一種吸附性較強(qiáng)的無機(jī)吸附劑

何瓊英等(1998)在苦丁茶體細(xì)胞組織培養(yǎng)前，將苦丁茶莖段經(jīng)常規(guī)消毒后用可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP，2g/L）浸泡10-15min，并在培養(yǎng)基中加入活性炭（AC，1g/L），獲得較好的防褐效果。第15頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五

黃浩(1999)認(rèn)為水解乳蛋白的抗褐變?cè)蛞环矫媸侨跛嵝晕镔|(zhì)與酚類的羥基作用形成酯類，減少PPO作用底物的濃度；一方面是水解乳蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地與底物結(jié)合的結(jié)果。亞硫酸鹽可直接抑制酶，它與反應(yīng)的中間體相互作用阻止中間體參與反應(yīng)形成褐色色素，或作為還原劑促進(jìn)醌向酚的轉(zhuǎn)變。第16頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五五.多次轉(zhuǎn)移將外植體很快轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上2-3次，在某些情況下可以緩解褐化，可能是在這段時(shí)間內(nèi)外植體的切口逐漸愈合，外滲停止的原因。在蘭花、無花果、核桃的組培中使用了這個(gè)方法，收到了良好效果。在外植體接種后的1-2天立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中或同一瓶培養(yǎng)基的不同部位，這樣能減輕醌類物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次可基本解決外植體的褐變問題。

（此法比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，應(yīng)是克服褐變的首選方法,但是工作量大）第17頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五

展望1.在植物組織培養(yǎng)中引起褐化的因素是復(fù)雜的，既有培養(yǎng)物自身的原因，也有培養(yǎng)環(huán)境的影響，而且往往是多種因素同時(shí)作用的結(jié)果。因此,深入了解有關(guān)機(jī)制對(duì)于從理論上認(rèn)識(shí)組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象，找到影響褐變的主導(dǎo)因子和克服褐變的有效方法，并從實(shí)踐上防止褐化的發(fā)生，對(duì)解決組織培養(yǎng)生產(chǎn)中的褐化這一難題，促進(jìn)組織培養(yǎng)技術(shù)的日臻完善具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。2.酶促褐變存在著不同物種間的基因型差異，因此對(duì)褐化較輕或不易褐化的植物種群進(jìn)行遺傳特性的研究，進(jìn)而控制褐化也將是一條合理途徑。第18頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五3.植物組織培養(yǎng)中，易褐化材料常常伴隨生根難的問題，因此，對(duì)組織培養(yǎng)過程中褐化與生根關(guān)系的研究也有深遠(yuǎn)的意義。第19頁，共21頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)8分，星期五

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