神經(jīng)源性膀胱M2受體mRNA的變化【關(guān)鍵詞】膀胱神經(jīng)源性受體毒蕈堿疾病模型動物RNA信使1材料和方法1.1材料1.1.3引物2受體和內(nèi)參GAPDH引物用Prier軟件設(shè)計,由上海生工生物工程技術(shù)效勞合成。序列如下:2受體:內(nèi)參GAPDH:1.2方法1.2.1神經(jīng)源性膀胱動物造模根據(jù)文獻[1]并加以改良。動物麻醉后,沿L4~6棘突間作縱形切口,暴露L4~6棘突,咬除L5棘突及椎骨,暴露脊髓。骶上型以剪刀完全銳性橫斷L4~5椎間隙程度脊髓;骶下型在橫斷脊髓后用探針向下完全鈍性破壞橫斷面以下脊髓,并充填無菌明膠海綿。對照組未行手術(shù)。1.2.2膀胱尿道造影及尿動力學(xué)檢測造模3個月后行膀胱尿道造影及尿動力學(xué)檢測。犬麻醉,仰臥位,膀胱置入8F紅色尿管,注入76%復(fù)方泛影葡胺溶液,在數(shù)字減影機器監(jiān)視下攝片完成造影。以卵圓鉗撐開陰戶口,暴露尿道外口。7F膀胱測壓管經(jīng)尿道置入膀胱,注射器抽空膀胱尿液。9F直腸測壓管置入直腸,充盈氣囊。零點壓力定為大氣壓下恥骨結(jié)合程度。排除導(dǎo)管內(nèi)氣體,儀器調(diào)零。采用微量輸液泵經(jīng)7F膀胱測壓管的頂孔向膀胱內(nèi)勻速(40L/in)灌注生理鹽水,側(cè)孔連接壓力換能器,A:正常;B:骶上型(膀胱容量減少);:骶下型(膀胱容量增大).1.2.3標(biāo)本采集和處理完成上述步驟后,氯胺酮肌肉注射,行下腹正中切口,暴露膀胱,每組每只犬切取膀胱體部約1×1組織,放入DEP水處理過的凍存管,立即放入液氮罐保存運輸。1.2.4組織總RNA提取標(biāo)本逼尿肌肉組織勻漿后,參照RNAisReagent說明書提取總RNA。PR反響體系模板2μL,引物(上游)0.5μL,引物(下游)0.5μL,10×Buffer2.5μL,ExTaq酶0.2μL,無菌雙蒸水18.8μL,以消毒雙蒸水補足25μL。條件:94℃5in→94℃40s→60℃40s→72℃40s,共35個循環(huán);72℃10in。PR產(chǎn)物10μL于1.5％瓊脂糖凝膠電泳,紫外光凝膠成像并測定其灰度值,與相應(yīng)的內(nèi)參照GAPDH比值表示為最終結(jié)果。1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進展多個獨立樣本非參數(shù)檢驗,3組間的兩兩比擬使用2組間的非參數(shù)檢驗,檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。2結(jié)果2.1神經(jīng)源性膀胱模型尿動力學(xué)檢查見表1。膀胱尿道造影見圖1。3討論3.1動物模型的構(gòu)建神經(jīng)源性膀胱動物模型多種,有糖尿病性、脊髓損傷性神經(jīng)源性膀胱等。脊髓橫斷是制作神經(jīng)源性膀胱的根本方法,可以采用多個部位,假設(shè)橫斷脊髓平面過高,動物常因呼吸衰竭和植物神經(jīng)反射亢進而死亡。犬的脊髓圓錐細而長,從第3腰椎平面一直延伸到第6腰椎平面,其中第1骶髓節(jié)段位于第5腰椎平面[2]。故本實驗選取L4~5橫斷脊髓,保證了骶髓排尿中樞,也減少了自主神經(jīng)反射異常對膀胱功能的影響。脊髓損傷的動物模型可以選擇使用大鼠、兔、貓、犬、豬、猴等。在制作神經(jīng)源性膀胱模型中多數(shù)采用大鼠,一方面是大鼠生命周期相對短,另一方面飼養(yǎng)本錢較低。但是犬神經(jīng)根粗大,是神經(jīng)刺激的重要動物模型;犬體積較大,易進展手術(shù)操作。另外,在動物脊髓損傷后,大動物(如豬、犬、貓等)大多較快形成反射性排尿,其脊髓休克期甚短,而小動物(如兔、大鼠)脊髓損傷后,常不能短期內(nèi)形成反射性排尿,需人工協(xié)助排尿,每日3~4次,不協(xié)助排尿,動物常在數(shù)日內(nèi)死亡[3]。骶上型神經(jīng)源性膀胱由于離斷了膀胱排尿低級中樞與高級中樞的聯(lián)絡(luò),膀胱的功能表現(xiàn)為反射性亢進,相當(dāng)于上運動神經(jīng)元損害表現(xiàn)。膀胱出現(xiàn)無抑制性收縮,膀胱容量減少,壓力增大。而骶下型神經(jīng)源性膀胱是膀胱失去了骶髓排尿中樞的支配,表現(xiàn)為尿潴留,膀胱容量增大,壓力降低[4]。本研究選擇犬觀察尿流動力學(xué)關(guān)鍵指標(biāo),看到骶上型膀胱較骶下型容量減少,骶上型壓力較骶下型增大;順應(yīng)性骶上型低于骶下型;膀胱造影證實膀胱容量的變化。這些變化主要是由膀胱收縮性改變所致,骶上型膀胱逼尿肌收縮性加強,骶下型膀胱逼尿肌收縮力減弱,而骶下型逼尿肌壓力與對照組比擬無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示骶下型由于控制排尿的低級中樞受到破壞,形成高順應(yīng)性膀胱,在充盈期膀胱壓力變化不顯著。3.22受體的變化受體介導(dǎo)膀胱逼尿肌的收縮。根據(jù)分子生物學(xué)和藥理學(xué)方法,受體分為5個亞型〔1~5〕,在許多物種的膀胱逼尿肌中都已經(jīng)得到證實,其中2、3受體占絕大多數(shù)[5],而且2受體在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢。在鼠的膀胱中,2∶3大約為9∶1,在豬和人膀胱中大約為3∶1。本研究對照組和實驗組均可以表達2受體的RNA,證實犬膀胱逼尿肌中存在2受體。通過測定2受體的凝膠灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值,可以半定量比擬2受體,骶上型組較骶下型組和對照組都增加,而骶上型神經(jīng)源性膀胱逼尿肌的收縮性在3組中最高,提示骶上型神經(jīng)源性膀胱的逼尿肌收縮性的增加可能與2受體上調(diào)有關(guān)。2受體在逼尿肌受體中比例最多,但是它在正常膀胱組織中不能直接介導(dǎo)逼尿肌的收縮,一般認為2受體是與Gi蛋白偶聯(lián),減少了AP的產(chǎn)生,逆轉(zhuǎn)了β腎上腺素能介導(dǎo)的舒張,間接介導(dǎo)逼尿肌收縮[6]。但是inru等通過運用3受體基因敲除小鼠的研究認為2受體在膀胱收縮中可以發(fā)揮作用,但不是主要作用[7]。近來有研究認為,2受體在病理狀態(tài)膀胱(如神經(jīng)源性膀胱、糖尿病性膀胱、流出道梗阻膀胱等)中與正常膀胱的作用機制有所不同。Pntari進展人神經(jīng)源性膀胱逼尿肌條的體外實驗,根據(jù)逼尿肌條的不同拮抗劑的藥理親和力,認為在人的神經(jīng)源性膀胱中,2受體直接介導(dǎo)了膀胱逼尿肌的收縮[8]。Tng研究病理性糖尿病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)糖尿病膀胱逼尿肌中2AhR的RNA和蛋白生物合成增加,認為2AhR的上調(diào)可以減弱交感的舒張效應(yīng),導(dǎo)致了逼尿肌的不穩(wěn)定[9]。本實驗中,膀胱收縮力增強的骶上型神經(jīng)源性膀胱逼尿肌2受體RNA表達量增加,提示2受體RNA上調(diào),說明2受體可能直接參與介導(dǎo)了犬神經(jīng)源性膀胱中逼尿肌的直接收縮。Ruggieri通過去神經(jīng)膀胱和流出道梗阻膀胱的研究發(fā)現(xiàn)2