一、標(biāo)曲和擴(kuò)增效率相關(guān)答：看，肯定是可以看，沒有任何問題。但事實(shí)上這個(gè)擴(kuò)增效率沒有辦法通過簡(jiǎn)單的方式1.414，并不清楚。0，終點(diǎn)時(shí)這個(gè)值越大是不是這條線越立，所以標(biāo)曲才是檢后續(xù)拿樣本做Q實(shí)驗(yàn)時(shí)能否用之前做的標(biāo)準(zhǔn)曲線？這個(gè)時(shí)候閾值是否要和標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定的閾值放在一起一板，這樣一板一板子之間進(jìn)行傳遞DeltaCt是沒問題的。呢？（就是這個(gè)問題的意思就是說他先做了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線了，后面在保持這些東西都不變像有這么一個(gè)問題，啊，意思是什么呢？就比如說啊，做標(biāo)曲的時(shí)候，這，這個(gè)下面講的這個(gè)，僅僅限于這個(gè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線去驗(yàn)證體系有沒有效，我是檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率，的應(yīng)該都知道，最的是質(zhì)粒對(duì)吧。如果質(zhì)粒不行，那就pcr產(chǎn)物。如果pcr產(chǎn)物還去測(cè)定，對(duì)吧？這個(gè)也是可以的，但是比如說本來如果不稀釋cDNA原液的話，的ct都已稀釋呢，它就已經(jīng)那個(gè)樣子了，對(duì)不對(duì)？對(duì)吧？除了最后還有一個(gè)別的辦法，就是如果ct值比102倍啊，2.5倍啊，什么你想怎么稀釋都可以，只要把握住標(biāo)曲計(jì)算方式，橫坐標(biāo)是什么，縱坐標(biāo)是什么也行。但是，我不，為什么？稀釋倍數(shù)越小，測(cè)出來的標(biāo)曲越，什么道理呢？就像一個(gè)桿一樣，如果掐住一個(gè)點(diǎn)，它是一下子效率就會(huì)變，對(duì)吧？所以不太，那還有一個(gè)辦法呢，就比如說是像比如測(cè)組拿怎么做，對(duì)吧？我做一條標(biāo)曲出來，然后把樣本一測(cè)ct值，假如說這么大，我把logN0能夠 那第三個(gè)問題，答案是可以。這個(gè)問題呢，我是說有兩個(gè)不同的，那這兩個(gè)想一份樣本只是去檢測(cè)每個(gè)跟目標(biāo)，每個(gè)目標(biāo)跟內(nèi)參的比例，然后呢，去確定這兩個(gè)之間表達(dá)量的比例。這個(gè)是可以的。但是有一些前提，一會(huì)兒再說前提，先說它的原理是什么。內(nèi)參呢，在的講座里面有，它提供的是一個(gè)濃度這么一個(gè)概念。內(nèi)參的ct值小，那它就是濃度低，表示模板濃度低。內(nèi)參 比如20， A呢22，B23那這個(gè)時(shí)候，其實(shí)相對(duì)于什么呢，相對(duì)于內(nèi)參 （A）（？t就可-△△Ct，2-△Ct2-△Ct過t表2-△△C，2△Ct1ulu用-△Ct來算啊，這問啊可??！bu，凡都有but擴(kuò)率什么A跟BA跟B15那這個(gè)時(shí)候呢，你用最后的熒光比CtCt而且都要保證它大于0.9（張總?cè)绻鸄B的擴(kuò)增長度不一樣的話可以直接比較嗎？理論上這個(gè)問題解釋清楚了沒有？（絕對(duì)定量，我一直理解的是絕對(duì)定量的時(shí)候，是要做這種長度校正，那做相對(duì)定量的時(shí)候，這個(gè)要不要也要長度校正？）額，不是說絕對(duì)定量要做長不同的文庫它長度不一樣對(duì)吧？所以要進(jìn)行校正。但是平時(shí)做的就是這種法這種定量2-△△Ct其實(shí)相當(dāng)于什么呢？內(nèi)參跟內(nèi)參比，目標(biāo)跟目標(biāo)內(nèi)參長度肯定是一樣的，對(duì)吧？那這個(gè)比值是給你濃度的信息，目標(biāo)跟目標(biāo)的長度肯A和B這個(gè)時(shí)候是需要，因?yàn)樗鼈儍蓚€(gè)長度不一樣，你相當(dāng)于2的-△△Ct還是內(nèi)來，A是B表達(dá)的多少倍，然后你需要乘以一個(gè)長度因子，在另外一個(gè)樣品你一樣需6、單頁上面產(chǎn)品做的標(biāo)曲擴(kuò)增效率在90-96%單頁的問題，我把ChamQAceQ的單頁分出來了，其中確實(shí)有一個(gè)-3.5幾，下次印的時(shí)（中，有一個(gè)概念，不同的確實(shí)不一樣，當(dāng)時(shí)是2012年做得數(shù)據(jù)，可能當(dāng)時(shí)做的，當(dāng)時(shí)還是就是說大家腦子里有一個(gè)概念們，帶ROX縱坐標(biāo)的絕對(duì)值一般是什分子水平，不帶steponeROX5左右，個(gè)位數(shù)，如果你發(fā)現(xiàn)帶客戶縱坐標(biāo)的值是零點(diǎn)幾，ROX去掉8 現(xiàn)在兩個(gè)產(chǎn)品，一個(gè)AceQ，一個(gè)ChamQ，相對(duì)來講ChamQ的平臺(tái)期會(huì)更高一些，高的原因不是說ChamQ能擴(kuò)出來分多的產(chǎn)物， 的原因是ChamQ的 線期矯正的問題，而導(dǎo)致曲線頭朝下，或者說出現(xiàn)弧狀的那種曲線（如圖1baseline，baseline這個(gè)數(shù)值怎么去設(shè)置，依靠什么，可以有一個(gè)小方法，首先呢，把擴(kuò)增曲線切換到liner模式，切換完了之后呢，應(yīng)該看到（如圖2）這種情況，往往你會(huì)看到這種樣子(如圖3)，期擴(kuò)增，這只是我猜測(cè)，其它的就真不知道什么原因了，反正設(shè)計(jì)的引物從來沒碰到過這種問題，如果碰到這種情況的話，客戶如果說要去調(diào)整，怎么去看指數(shù)這個(gè)設(shè)置到這個(gè)地方就可以了，就是標(biāo)A處，所以你要的是把指數(shù)期凸顯出來，所以你通過baseline設(shè)置來能夠把這條線拉回到基線區(qū)域，設(shè)置baselline很簡(jiǎn)單，就相當(dāng)于你在變化一個(gè)坐線順時(shí)針這樣子轉(zhuǎn)，要不你認(rèn)為坐標(biāo)軸逆時(shí)針這樣子轉(zhuǎn)都行，所以這樣子去設(shè)置baseline的起點(diǎn)和終點(diǎn)，注意啊，stepoone或者Q6一些，比較新的儀器里面，每個(gè)都可以設(shè)置自己的起 9、為什么擴(kuò)增平臺(tái)期時(shí)常有高有低，差距多大時(shí)，數(shù)據(jù)時(shí)常不，有高有低的原因就是碰撞反應(yīng)的隨機(jī)性，那彩頁上面有一張圖，不知道大家應(yīng)該看過吧，4896個(gè)孔，然后去做反應(yīng)的時(shí)候，你會(huì)發(fā)現(xiàn)平臺(tái)期，拐點(diǎn)期，指數(shù)增長期這些都尤其是擴(kuò)增產(chǎn)物，其實(shí)如果你把組的蓋子打開了，它污染的概率是不大的，因?yàn)榻M的留在空氣里面就叫氣溶膠，因?yàn)榭諝饫锩娑加蟹肿勇铮ㄌ釂枺何依镆呀?jīng)有污染了，我把這個(gè)放了一年半了再進(jìn)來做可以嗎？）可以啊，三個(gè)月，如果想快一點(diǎn)，可以通風(fēng)然后用一些氧化劑，比如說弗里茨（49:21，巴氏類的強(qiáng)氧化劑液可以加速它的失效，讓它分解，做過實(shí)驗(yàn)的都知道，一旦污染，像這邊污染的時(shí)候，肯定需要2周到3周的時(shí)間，甚拷貝數(shù)比較高，檢測(cè)的表達(dá)量比較高的時(shí)候這種東西有的話就有吧，無所謂，但如果說你本身的本底的Ct值就很高了，你的的Ct值也很大，那肯定得照顧，取決于你知不知道，估計(jì)學(xué)那會(huì)還不知道氣溶膠，有很多人，像我上學(xué)的時(shí)候就不知道，當(dāng)時(shí)我就很奇怪，我以前做過一個(gè)轉(zhuǎn)的體系，完了以后我當(dāng)時(shí)做了敲除，敲完了以后怎么檢測(cè)呢，一管或者幾越多，所以這個(gè)時(shí)候，你像臨檢的，都是非常嚴(yán)格的，單向走，正負(fù)壓，然后獨(dú)立的循環(huán)系立的風(fēng)控系統(tǒng)，然后凈化隔膜，那個(gè)都非常嚴(yán)格的，然后能不跑膠就不跑膠，這個(gè)NTCNRT的溶解曲線都是跟目的產(chǎn)物有一個(gè)同樣的峰，是不是就證明污染了？因?yàn)閹缀踹@個(gè)時(shí)候說這個(gè)東西有可能是組污染，可以解釋，NTC里面沒有得解釋，會(huì)出來的就是污染嘛，（你有客戶不污染嗎？）（水沒有那個(gè)峰，但是溶解曲線還是有的）只要做好解釋就行了，讓大家知道這個(gè)東西很的，以后這個(gè)模板還是要想個(gè)辦法，真正的做個(gè)模板出來，你玩完P(guān)CR產(chǎn)物怎么可能不污染嘛，必然的，躲不掉的。11、對(duì)于本身表達(dá)低的，不穩(wěn)定，重復(fù)性、特異性均不好甚至很多擴(kuò)不出來，Ct對(duì)于本身表達(dá)低的，不穩(wěn)定，重復(fù)性、特異性均不好甚至很多擴(kuò)不出來，CtCT值大，特異性差?PCR規(guī)律，當(dāng)有效的模板濃度越低，防止在不同的地方錯(cuò)配，正確好之后就可以不讓它推下去---特異性。ChamQ擴(kuò)大了擴(kuò)增效率---GC指鏈條上某些區(qū)域含量高，擴(kuò)增過程中會(huì)形成各種結(jié)構(gòu)，退火強(qiáng)度很高，是ChamQ70%GC不是做不了，測(cè)試沒有問題。問：AceQ GCGC擴(kuò)增的適應(yīng)性更強(qiáng)或者對(duì)引物T總會(huì)配對(duì)的，四種堿基自己和自己配對(duì)的可能是有的。單個(gè)堿基是可以退火的，所以引物二如認(rèn)為在反應(yīng)溫度下，ΔG（內(nèi)能的熵值的變化）大于一定數(shù)值的序列容易形成引物二聚體。這種計(jì)算方法建立在Tm值上，所以引物一旦退火，就要考慮退火溫度的問題。Tm值的前提下。溫度高了，相當(dāng)于將引物往外推，不易與Ct值大（＞30開始）的時(shí)候，重復(fù)性變差；Ct值小的時(shí)候，重復(fù)性較好。這個(gè)復(fù)孔，就是因?yàn)镃t值大（＞30開始）的時(shí)候，重復(fù)性變差。在檢測(cè)某個(gè)的表達(dá)量時(shí)，沒有正常人的樣本，怎樣確定這個(gè)的變化？實(shí)驗(yàn)時(shí)，找不到一個(gè)內(nèi)參，那可以只用目標(biāo)來檢測(cè)這個(gè)制會(huì)很，如果只是定量一個(gè)樣本，還好辦，但是定量多個(gè)樣本時(shí)，比較的話會(huì)很。因桿菌，直接使用了GAPDH，且說是參考過文獻(xiàn)的。類似案例比較多。但是，找不到內(nèi)參，相王瑤：在做分化的時(shí)候，就不可以使用Actin做內(nèi)參。張博：沒有規(guī)定，一定使用Actin種，每個(gè)物種整理30對(duì)引物，然后花點(diǎn)錢，在實(shí)驗(yàn)里驗(yàn)證，之后留下來，就可以放到 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)可以展示的試劑擴(kuò)增效率，也可以證明內(nèi)參可用。就是做80條標(biāo)曲，一個(gè)星期就可以解決。 有客戶說查到一些文獻(xiàn)里用-ΔΔCtlg2比用2--ΔΔCt去計(jì)算的 的區(qū)別就是將2-ΔΔCtlg值。還記得2-ΔΔCt是什么意思嗎？有人能看懂嗎，我沒看懂。223311王萍：是高海燕在講座的時(shí)候，遇到的客戶問題。張博：可以跟客戶這樣講，發(fā)不章，有沒有影響，請(qǐng)客戶自己決定。在數(shù)據(jù)準(zhǔn)或者的問題。不糾纏這個(gè)問題。如果以前沒有做標(biāo)曲，并不代表數(shù)據(jù)就不對(duì)，可以再驗(yàn)證。如果明明知道數(shù)據(jù)有問題，又不去驗(yàn)證，問的問題就沒有意義了。只是數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的王瑤：我覺得也很少說，一個(gè)全部實(shí)驗(yàn)是Qpcr就章了，一般也會(huì)有別的實(shí)驗(yàn)。張博：Qpcr實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一般很少做主導(dǎo)，以前可能還可以。這個(gè)問題經(jīng)常被問及。具體實(shí)驗(yàn)過程中采用統(tǒng)計(jì)方法客戶可以自己選擇，這里介紹一個(gè)最常用的方法?？蛻糇钕胫赖氖潜磉_(dá)差異倍數(shù)分析，以兩個(gè)樣品A，B為例，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)通過2-ΔΔCt計(jì)算得到一個(gè)倍數(shù)值例如3.3，5.5，8.5（QPCR這種數(shù)據(jù)分布是很正常的，沒有關(guān)系；根據(jù)這三個(gè)數(shù)值取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差±SDSEM（SEM=SD/N）做表達(dá)差異圖譜，兩最關(guān)鍵的問題。以一個(gè)案例為例：兩組實(shí)驗(yàn)，A為組，B為陽性組；A通過ΔCt計(jì)算方法ΔCtA1，A2，A3；BΔCtΔCtB1，B2，B3;再用2-ΔΔCtB標(biāo)準(zhǔn)差作表達(dá)差異圖分析，這種方法是2-ΔΔCt計(jì)算方法得到三個(gè)數(shù)據(jù)，這應(yīng)該是作圖時(shí)計(jì)算該組標(biāo)準(zhǔn)差依據(jù)來計(jì)算陽性組每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的2-ΔΔCt這種方法也是可以的。大家都搞清楚了對(duì)吧？這個(gè)我大家回去好好的算一下，畫一下，取些實(shí)際的例子，真正把它搞懂，要不然的話客戶幾句話就繞暈了，如果搞不清楚，自己拿2-△△Ct去推，這個(gè)能跟熒光Tm值，經(jīng)常有人會(huì)問為什么的Tm值和別人的不一樣，大家都能解釋了對(duì)不對(duì)？Tm值只是在一定的反應(yīng)環(huán)境下，pH、離子強(qiáng)度等等，一系列的因素綜合決定的，TmDNA的長度和GC含量的變化，越Tm值越大，GC含量越高Tm值越大，所以理論上來講，存在兩個(gè)產(chǎn)物Tm7080度就不是引物二聚體，這種推論是不正確的。都測(cè)完，你就可以通過Tm值來判斷這到底是引物二聚體還不是了，不換試劑，不換程序，不換一般都是60左右，兩條引物加一起，一條20一定要有式去想，因?yàn)閯偛胚@種推理過程，就是客戶在刁難你的過程，你說一個(gè)東西，他跟你唱一個(gè)反調(diào)，他跟你挑一個(gè)刺，你說到他最后，總可以吧？這個(gè)肯定可以確認(rèn)了。如果產(chǎn)物不唯一怎么辦，多測(cè)幾個(gè)嘛！總是有辦法的。還有剛剛說到臨界值的問題，50%的概率能做，50%的概率不能做，那就一點(diǎn)，引物濃度以前低，那就多加一點(diǎn)，以前高就少加一點(diǎn)，什么叫低，什么叫高？的那叫適中，比的高就叫高，比的低就叫低，比如講退火溫度，60度，而發(fā)現(xiàn)條帶若有若無，我可以嘗試下降溫度，打破模型，讓它往那個(gè)退火的方向，調(diào)整都是從 假如說原來的問題是因?yàn)榻怄湶缓茫俏已娱L時(shí)間肯定會(huì)變好嘛；那如果是因?yàn)椴嫘纬捎性黾覯g2+是增加非特異性擴(kuò)增的幾率還是增加錯(cuò)配DNA濃度那么高，這個(gè)大家可能不TmDNA磷酸骨架上的復(fù)變性，綜合后的兩條鏈的排斥下降，氫鍵增強(qiáng)，所以Tm值上升，但是Mg2+有沒有這個(gè)功能我不知道，濃度太低了測(cè)摩爾，9個(gè)毫摩爾，甚至的時(shí)候，有的時(shí)候你會(huì)發(fā)現(xiàn)它不能擴(kuò)，這是為什么，我也搞不清增加Mg2+，酶的活性會(huì)增加，這個(gè)能夠理解，但是有客戶提到隨機(jī)突變的問題，用taq，讓對(duì)，一般像errorpronepcrPCRPCR，像這種東西一般都用錳，性的酶，也不能夠把能夠匹配的片段切掉重新聚合，也就是這種二結(jié)構(gòu)的叉，最大的Proof-reading活性在于這種非匹配區(qū)域，比如說我在這個(gè)地方本來應(yīng)該上一個(gè)C，我上18minProof-不會(huì)動(dòng)到引物序列的，所以客戶說為什么這個(gè)引物出現(xiàn)了突變，肯定是酶的保真度不行，你可以，這塊區(qū)域是不會(huì)動(dòng)的，一定是引物的時(shí)候出錯(cuò)啦。剛剛說的校正活性嘛，QChampTaq和AceTaqTaq酶，本身就35Proof-reading3’到5’外切不一樣，它的功能是3’到5’的外切，從外往里切，那比如說舉個(gè)例子，大腸3T4聚合酶，T4PdNTP的時(shí)候，它可以把整個(gè)20min，至切成，把這條鏈解開，T4Proof-reading35’外切酶活性。但是phanta，pfu，KOD，PrimeStarProof-reading35’外切酶活性。是類似3’到5’外切酶活性，切除了非匹配區(qū)域，方向相使的功能不同。所以，T4聚dNTP的時(shí)候。有dNTP的時(shí)候，聚合和切除是平衡的過程，dNTPA:T:C:G=1：1：1：1Taq酶也有保真度的概10-5dNTP的比例有變化時(shí)，AA錯(cuò)配的概率也會(huì)大幅增加。所以，dNTP的質(zhì)量對(duì)保真度也很重那拼什么說雜峰的高度不超過主峰的20%就可以用。有雜峰，說明，在擴(kuò)增的某個(gè)階段，00:26:24Ct值在后面，就是定量結(jié)果偏高，即N0+X。上次在 的真假。數(shù)據(jù)是否能用，取決于N0和X的比例。比如說N0是10，X是1，那1/10的誤差是可以忽略的。比如定量后是5，10%的誤差是4.5，20%的誤差是4，50%的誤差是2.5。數(shù)據(jù)會(huì)有上倍數(shù)其實(shí)沒太大關(guān)系，關(guān)心的是表達(dá)多了還是少了。所以更應(yīng)該關(guān)注的是N0和X間的區(qū)別，N0=1X=101+11+（可以忽略。需要透徹了解，不能說峰低，雜峰和主峰的比例就反應(yīng)到N0和X比例。熔00:29:52，DNA越多就越高，越多就相當(dāng)于起點(diǎn)越高，這條線就越立，K的值越負(fù)，對(duì)應(yīng)的這個(gè)值越1/51/5時(shí)它所占的比例，從qPCR而言沒多大關(guān)系，對(duì)于初步試驗(yàn)只想看趨勢(shì)是可以的，20%可以理解是經(jīng)驗(yàn)值。21、GCTAKARA70%GC樣答：現(xiàn)在在售的兩個(gè)試劑GC含量都可以達(dá)到70%以上，都測(cè)試過，兼容性不錯(cuò)，但是從GCAceQ，這個(gè)之前在廣州的客戶做過測(cè)試。GC含量和 過MicRNA的市場(chǎng)，SNP的分型市場(chǎng)，其實(shí)很多，每一個(gè) 實(shí)驗(yàn)，你問干嘛。你跑到一個(gè)天天跑western的 ， 的takara的protocol嗎答：ChamQroxrox的，帶的，不帶的，但是AceQ有個(gè)客戶說95℃，2min也能做，做得挺好的。這種就是體系比較簡(jiǎn)單嘛，加熱時(shí)間長時(shí)間短，只不過是酶活出來的多跟少，對(duì)于簡(jiǎn)單的說高GC的時(shí)候，你去加熱2min試試看，肯定不能擴(kuò)嘛。他們發(fā)明的這個(gè)玩意，去原廠買，2000多買了一小管，不能用。種樣子。EVAGreen如果同樣的一個(gè)，同樣反應(yīng)條件，EVAGreen是這種樣子。SYBREVAEVAGreen曲線反正那個(gè) ，SYBRGreenEVAGreen比較的那個(gè)圖弄出來之后，小變化來去區(qū)分型的。它甚至可以區(qū)分到單突，就是單鏈突變都可以。那HRM最后出來不起，我還沒有研究過，我也不知道它怎么算出來的，但是反正呢它依靠，比如說，假如能擴(kuò)增了，PCR反應(yīng)是無法進(jìn)行的，所以，SYBRGreen的體系里面濃度是極低的。極低的C，或者把它突變以后呢，ATDNA里面，如果要體現(xiàn)在，做HRM的長度要非常非常短，長了之后都搞不了這個(gè)事情。但是如果你想啊，正好扯到那個(gè)地方的時(shí)候，那個(gè)地方?jīng)]有SYBRGreen，那你扯和不扯它都不 可以做HRM。EvaGreen可以。線丑對(duì)吧，但是我可以做HRM。如果要出一個(gè)hrm，很容易的嘛,換個(gè)就行了.但是要銷，腦子里面裝足夠多的東西，手里面拿足夠多的數(shù)據(jù)。你要用嘴說他，你就拿數(shù)據(jù)說服他。如果能上數(shù)據(jù)就不要?jiǎng)幼欤绻麤]帶資料嘛，你就得用嘴了。我覺得就現(xiàn)在的大部分sybergreen貴，這件事情是肯定的，人家都說SYBRGreenI和SYBRGold有什么區(qū)別呢？syber這個(gè)有很多，SYBRGreenI和式是一堆苯環(huán)，凡是發(fā)光的東西都一堆苯環(huán)，依靠共軛，然后在激發(fā)光下產(chǎn)生電子躍遷，GreeSYBRGold是在它側(cè)鏈上面有區(qū)別，具體什么區(qū)別我也沒有研究過。但是我知道有一個(gè)原則就是用于熒光定量法必須是SYBRGreenI，SYBRGree和SYBRGold都做不到，SYBRGold是用來干嘛的？SYBRGold是用來染膠的，很有可能是因?yàn)閭?cè)鏈的存在導(dǎo)致它會(huì)影響聚合反應(yīng)，可能SYBRGreenI對(duì)于聚合反應(yīng)的影響是最少的，但這個(gè)我沒有研究過，這---SYBRGreenI一般都會(huì)說雙鏈DNA它結(jié)合之后就發(fā)光，那SYBRGree 能不能和DNA---你說不好意思我不知道，如果你感，life的查一下好了，這是它賣的（這些染章，sybergreen結(jié)合單鏈及雙鏈都是可以的，但結(jié)合雙鏈的強(qiáng)度要比結(jié)合單鏈的強(qiáng)度要高一千倍，然后結(jié)合以后發(fā)光的時(shí)間是75個(gè)納秒。你在做逆轉(zhuǎn)錄或者Qpcr的時(shí)候干擾小。好處可能在于免沉淀，可能對(duì)于的小的片段會(huì)有好處。有問題，18S有問題，除了常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組，其他不都有問題么？磁珠做這些事情是可以，DNA可以，RNA也可以提。 答：也是指表達(dá)量么？細(xì)菌是原核生物，沒有polyA，問題在于逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候要么slikedoligosupermix也可以，supermixoligodT逆轉(zhuǎn)錄跟隨機(jī)引 答：MicroRNA的定量方法有兩種。LncRNA（longnon-codingRNA）跟RNA的區(qū)別在于60%lncRNApolyAlncsupermixpolyA的supermixlnc。那這個(gè)時(shí)候有客戶會(huì)擔(dān)心說polyAlncpolyAlnc，這兩種引物放在一起會(huì)不會(huì)有干擾。如果他這樣問的話，就用Select好了，自己去加隨機(jī)引物，那就都能轉(zhuǎn)了，或者用特異性引物（引物效---cellqpcr，相當(dāng)于一份細(xì)胞下來之后，不提取，直酶（這個(gè)酶其實(shí)已經(jīng)弄好了可以在RNA的末端去加若干個(gè)A出來，加了A之后，用在這個(gè)地方放一段特異性引物加上反向的通用引物，擴(kuò)oligodT。優(yōu)點(diǎn)在于逆轉(zhuǎn)錄的引microRNApolyARNA都會(huì)被它變成帶polyARNA都能被逆轉(zhuǎn)錄，所以產(chǎn)物很多，很microRNA匹配，逆轉(zhuǎn)錄后再設(shè)計(jì)一對(duì)引物做特異性引物，它不會(huì)轉(zhuǎn)那些無關(guān)的東西，所以干擾比較小。加A法的優(yōu)點(diǎn)就是莖環(huán)法的缺法的產(chǎn)品。像天根，NEB等都是加A法。kit。諾唯贊正準(zhǔn)備研發(fā)有關(guān)microRNA的試劑，上一批的自然基金出來后發(fā)現(xiàn)有特別多的都在做microRNA30-40%，所以現(xiàn)在正準(zhǔn)備做有關(guān)microRNA的試劑，這一塊也是目前逆轉(zhuǎn)錄和qPCR產(chǎn)品線的短板。的逆轉(zhuǎn)錄試劑現(xiàn)在不能用于加A法，可用于莖環(huán)法，qPCR試劑從本身來說都可以。后續(xù)會(huì)用現(xiàn)在的逆轉(zhuǎn)錄酶做一個(gè)使用方案出來讓其可以去做莖環(huán)法，然后開發(fā)出加A法。拿來的話?？梢韵朕k法征集。正在做這方面，所以后續(xù)數(shù)據(jù)都會(huì)出來。29.怎么對(duì)甲基化的片段進(jìn)行定量，的產(chǎn)品能用嗎？這個(gè)問題我有些看不懂，有人能解釋下實(shí)理解是甲基化不是還要對(duì)它進(jìn)行亞硝酸鹽處理嗎？處理以后不是C變成U嗎?如果是這樣的話，是不是可以理解為類似于檢測(cè)SNP或點(diǎn)突變？鹽處理完之后這個(gè)DNADNAC會(huì)不動(dòng)，因?yàn)榧證U，所以這里面會(huì)有一堆的U。問題就在這個(gè)地方，想要檢測(cè)出來甲基化有或沒有，其實(shí)很簡(jiǎn)單，用引物來區(qū)別就可以。因?yàn)橹灰o一種引物末端是G，另一種引物末端是A，引物末端是A的肯定不能擴(kuò)G的肯定不能擴(kuò)非甲基化的，但前提是，請(qǐng)大家注意，如果要干這個(gè)G的正向引物去測(cè)甲基化的量，那剩下的就是非甲基化的量了。我覺得產(chǎn)品是否UUdUTPdNTPTaq酶不怕，所以AceQChamQ。U的時(shí)候聚合效率會(huì)下降，dNTPdUTP以后，比影響，我沒做過所以不敢確定。除此之外，還有另外一個(gè)擔(dān)心，因?yàn)橹亓蛩猁}處理完后DNA會(huì)變成單鏈，而且PCR中不能有重硫酸鹽，所以這東西如何回收不清楚，而且用重硫酸鹽TaqdUTPPhantaUC這NEBphusiondUTP的產(chǎn)品，最早只有安捷倫有，叫PfuTurboCx，2012年的時(shí)候華大委托開發(fā)這類產(chǎn)品，因?yàn)槿A大買PfuTurboCx一個(gè)單位需要40元。我最近聽說的一個(gè)讓我對(duì)它原來印象挺的產(chǎn)品叫Herculase,不知道它哪里好PfuPfuPhanta之間的區(qū)別是一樣的，當(dāng)然好。我沒用過，它還行吧，不能說那么好，但是確實(shí)挺好，我覺得它確實(shí)挺好，比PhusionHRMMGB的探針，做SNP分型的那種探針也可以。最近也在考慮要不要做SNP分型市場(chǎng)，因?yàn)槲腋杏XProbe的張總：特點(diǎn)短，那就單點(diǎn)突變檢測(cè)好了。像就更簡(jiǎn)單， 現(xiàn)在一段，把引物放在的地方就是了?；蛘叻旁? 可以把探針放在片段里面，缺失可以把探針放在缺失的那個(gè)地方。點(diǎn)突變呢，帶GB變，不要用chamq，大家記住這句話。有一些特殊的原因不能用。31個(gè)問題說到這。32Taqman探針進(jìn)行等位或者M(jìn)GB的探針就可以檢測(cè)這條引物就可以。如果靠近這條引物，放在這個(gè)地方就好了。 張總：那剛才都了，講這么一堆，然后做也不是，不做也不是。這個(gè)真的是希望不管是來自銷售，還是來自于市場(chǎng)也好。真的能夠給一些支持，技術(shù)實(shí)力非常強(qiáng)，想干什么就張總：可以這么說吧。現(xiàn)在主要的方向，除了microRNA，然后其他的方向暫時(shí)是放場(chǎng)端呢，能夠跟銷售或者怎么樣的能收集到一些信息。告訴先干什么事情。想法呢很directPCR，這是可以搞的。它其實(shí)是有市場(chǎng)的，比如說做什么菌檢，提取肯定是一個(gè)麻煩事情，這是有的，directqPCR，法方面呢，包括快速的。我非常有信心可以把延料法的還要大，法有條溶解曲線，這個(gè)時(shí)間改不了。但是探針法沒有溶解曲線，可以讓整個(gè)循環(huán)15min內(nèi)結(jié)束。這個(gè)應(yīng)該是可以做得到的，但是這個(gè)東西有沒有市場(chǎng)，真的。然后呢，還有像這種SNPonestep這一塊的事情，產(chǎn)品很長時(shí)間都沒有動(dòng)過，38張總：我認(rèn)為還是那個(gè)老話，Aceq定位特異性，Chamq定位平衡或者偏效率。這個(gè)東西看怎么說嘛，Chamq相對(duì)于Aceq而言，特異性確實(shí)是變差了，這個(gè)是毋庸置疑的。那針對(duì)以前的Aceq出現(xiàn)像ctchamqtakara有一個(gè)相關(guān)性曲線嘛，這個(gè)應(yīng)該有足夠的信心，以前說和takara相比，很多是在95度30秒鐘加熱得到的一個(gè)結(jié)論?？蛻糁苯?5度30秒鐘做完了說ct值比takara大那么多。所以我覺得這兩個(gè)產(chǎn)品這樣定位沒有太大問題。不過像這邊，他們是把chamq做，aceq做高端。張總：因?yàn)樗兴牡赜蛱厥庑裕热缯f像交，是羅氏的天下。羅氏本來就很爛嘛對(duì)吧。但羅氏特異性確實(shí)還不錯(cuò)。所以呢，aceq相對(duì)來講進(jìn)入的可能性相對(duì)大一些。所以呢，他們把這個(gè)高的搭配，用aceq做高端，用chamq做。然后把價(jià)格拉開，拉開大概一百多塊蘇黎明：對(duì)，比如說客戶現(xiàn)在在用某個(gè)品牌，要去拿的方式去替換，客戶說這個(gè)比的好在哪。銷售就會(huì)講自己做過測(cè)試，的確實(shí)是有優(yōu)勢(shì)的。那你們的 張總：T嘛，takara是T嘛。Aabi。 的和takara的就是完全一樣的，那怎么體現(xiàn)的 講究一些商業(yè)道德，包括自己平時(shí)和客戶講要注意措辭，因?yàn)槟阍诒澈笳f別人的時(shí)候，別人也會(huì)對(duì)你有一些看法。當(dāng)把一世界的試劑都唾了一遍，自然別人也不會(huì)認(rèn)為你好。咱們自己宣傳要自重，這是方面的一些事情。實(shí)事求是，好就是好，不好就是不好。有特點(diǎn)，特異性好就是特異性好，有數(shù)據(jù)說明就可以了。不是說特異性比所有的，這種說法也 RT和q一套的。為什么。qRTQ一起做嘛，送了不用那是他的事，不送那是你的事。我相信應(yīng)RNA，然后發(fā)現(xiàn)TAKARA的RT用起來比的小2個(gè)ct值。問:對(duì)，所以他就買了的Q不要的RTChamQChamQAceQ好？ChamQColor的特異性和靈敏度跟AceQ和ChamQ相比又如何？答：ColorQChamQ一樣就可以了，沒什么區(qū)別。當(dāng)時(shí)出的報(bào)告就沒有再ChamQChamQ和那八家產(chǎn)品比過，做遺憾，所以會(huì)用提供白板這樣的方法去彌補(bǔ)。問：所以在試用裝的時(shí)候也都配了白板了答:可以了解一下客戶喜歡的稀釋方法，不行就改說明書，只是個(gè)稀釋方法的問題。問:這里會(huì)遇見一些做文庫定量的客戶，他們會(huì)用384孔的，對(duì)的ColorQ還比較感興趣，但是文庫定量是AceQ的。才是的目標(biāo)。現(xiàn)在推得目標(biāo)都是那些量大的，現(xiàn)在不是有那種自動(dòng)儀嗎？客戶要是量多的 肯定比AceQ好的。GC的時(shí)候它就差，也不能說的那么絕對(duì)。也不要搞那么復(fù)雜。ChamQ他優(yōu)化的方向就是一個(gè)靈敏度，ct值小你這么說沒問題。特異性來說，ChamQ是要略低于Ace