川楝黃酮分離與結(jié)構(gòu)研究楊海艷，宋先亮﹡北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京（100083）摘要：本文研究了用60%乙醇提取川楝黃酮，經(jīng)萃取分離，聚酰胺層析柱純化，用TLC法、顏色反應(yīng)和紫外分光光度儀分析其黃酮成分。研究結(jié)果表明，川楝黃酮中含有兩個黃酮醇類化合物，活性測試表明當(dāng)濃度達到0.5g/L時，化合物Ⅰ對O2-·的清除率達為69.57%，對·0H的清除率為74.19%；化合物Ⅱ?qū)2-·的清除率為65.22%，對·0H的清除率為73.12關(guān)鍵字：川楝、黃酮、結(jié)構(gòu)研究SeparationandIdentificationofFlavonoidsfromMeliatoosendanSieb.etZucc.YANGHai-yanSONGXian-liangCollegeofMaterialsScienceandTechnologyatBeijingForestryUniversity,Beijing(100083)Abstract:TheflavonoidsinfruitsofMeliatoowendanSieb.et.Zuccwasextractedby60%EtOH,separatedandpurifiedbyPolyamidechromatographicanalysiscolumn.TherearetwocompoundsidentifiedbyUV,TLCandcolourreactioninn-butylalcoholextractionsliquid,bothofthemareflavonolsandwithantioxidativeactivities.Thescavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalsis69.52%,whilethatonhydroxylfreeradicalsis74.19%atconcentrationofCompoundⅠ0.5g/L;Thescavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalsis65.22%,whilethatonhydroxylfreeradicalsis73.12%atconcentrationofCompoundⅡ0.Keywords:MeliatoosendanSieb.etZucc，flavonoids,structureresearch楝科植物川楝（MeliatoosendanSieb.etZucc.），又名金鈴子，產(chǎn)于亞洲熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國主要產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北等地。川楝含有川楝素、生物堿、山柰醇、樹脂、鞣質(zhì)等活性成分，在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其具有疏肝、止痛、驅(qū)蟲等功效。其果實類球形，直徑2～3cm，具深棕色小點，氣特異，味酸、苦，主要藥用成分為川楝子素、生物堿等，用于胸脅、脘腹脹痛、疝痛、蟲積腹痛等癥。此外，川楝子還被常用來治療乳腺炎、乳腺增生等乳腺病?；痦椖浚罕本┝謽I(yè)大學(xué)大學(xué)生科研培訓(xùn)計劃（200705010）作者簡介：楊海艷（1986.5-），女，重慶市忠縣人，北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院林產(chǎn)化學(xué)加工工程學(xué)生;E-mail:yhaiyan630@126.com通訊作者：宋先亮，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物活性成分的提取分離及鑒定研究，E-mail:hdmsxl@黃酮類化合物的藥用價值很高，具有強化免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)免疫功能、吸收活性自由基、具有抗癌、抗自由基氧化、抗衰老、抗病源微生物、抗炎癥、抗感染、抗?jié)?、抗痙攣、抗輻射、抗腫瘤、改善血液循環(huán)狀態(tài)、促進組織再生、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、減少黑色素生成、消除黃褐斑等多種功能[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，川楝總黃酮提取物具有較高的抗氧化活性，而其具體結(jié)構(gòu)不清楚，本文對川楝總黃酮提取物進行分離，確定其結(jié)構(gòu)[3]，有利于川楝的開發(fā)利用。1.實驗部分1.1原料川楝子，采于四川省宜賓市林業(yè)局1.2儀器與主要試劑紫外分光光度計、硅膠板（50×100mm）、蘆丁、無水乙醇、甲醇、甲醇鈉、氯仿、石油醚Ⅱ（60-90）、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、冰醋酸、三氯化鋁、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸鈉、硼酸、鎂粉、鋅粉、聚酰胺（60-90），試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3黃酮類化合物的提取川楝子去核,用體積濃度60%的乙醇,料液比1：20，70℃水浴提取1h，提取兩次，合并提取液減壓濃縮至膏狀，加熱水溶解浸膏，依次用石油醚萃取三次、乙醚萃取三次、乙酸乙酯萃取五次、正丁醇萃取三次，回收萃取劑。取正丁醇萃取物反復(fù)柱層析，層析柱為5cm×30cm開口柱，用梯度乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮結(jié)晶1.4結(jié)構(gòu)鑒定1.4以正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5作為展開劑，用硅膠板進行薄層層析，記錄斑點紫外顯色反應(yīng)，計算Rf值。1.4樣品溶液與HCl-Zn、HCl-Mg、10%NaOH、AlCl3、MgAc2、H2S046種顏色反應(yīng)試劑反應(yīng)后在可見光和紫外光下觀察其顏色變化。1.4.用甲醇將樣品溶解，在紫外分光光度計上于190-600nm范圍分別測定“甲醇”譜圖、“甲醇鈉”譜圖、“AlCl3”譜圖、“AlCl3/HCl”譜圖、“NaAc”譜圖、“NaAc/H3BO3”1.5抗氧化活性的測定1.5.1對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除借助一種簡單的化學(xué)方法即利用過硫酸銨/N，N，Nˊ，Nˊ，-四甲基乙二胺體系產(chǎn)生O2-·與羥胺反應(yīng)生成NO2-，經(jīng)對氨基苯磺酸和α-萘胺顯色在530nm處有特征吸收峰。AP-TEMED體系溶液的配制如下[4]：表1AP-TEMED體系溶液配制表Table1PreparationofAP-TEMEDsystem儲存液成分加入量A:HCl(1mol/L);48.6%三羥甲基氨基甲烷（tris）366g/L;B:N,N,N,N,-四甲基乙二胺（TEMED）;0.23%過硫酸銨（AP）1.4g/L在25℃時，取A液0.4mL,B液1.6mL按體積比1:4混合反應(yīng)1min,分別加入不同濃度的樣品溶液1mL,再加入10mmol/L的鹽酸羥胺0.4mL,混合反應(yīng)20min,往各管加入17mmol/L對氨基苯磺酸2mL和7mmol/Lα-萘胺2mL,在25℃反應(yīng)混合繼續(xù)反應(yīng)25min,反應(yīng)后的顯色溶液用同樣體積的正丁醇充分搖勻,靜置或離心分層,取正丁醇相測530nm處吸光值,以加1mL蒸餾水為對照樣。清除率=（A-B）/A×100%，式中A為對照樣A530值，B為不同濃度待測液A5301.5.2對羥自由基（·由Fenton體系產(chǎn)生羥自由基，并加入水楊酸進行有效捕捉，在510nm處有強吸收峰。若加入具有清除·0H的物質(zhì)，便與水楊酸競爭使吸光值減少。在10mL比色皿中依次加入7.5mmol/L硫酸亞鐵銨1mL，7.5mmol/L水楊酸1mL，0.1%H2021mL，tris-HCl緩沖液2mL,最后分別加入一定濃度的樣品1mL,室溫靜置2h,在510nm處測其吸光值。清除率=（A-B）/A×100%，式中A為不加樣品的A510值，B為不同濃度待測液A510值[3]。2.結(jié)果與討論2.1TLC分析以正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5為展開劑，作薄層層析，得到兩個斑點，說明有兩個化合物?；衔铫裨?54nm紫外光下顯黃色，Rf=0.59；化合物Ⅱ在254nm在紫外光下顯黃色，Rf=0.72。2.2顏色反應(yīng)兩種化合物與6種顏色反應(yīng)試劑作用結(jié)果如下：表2顏色反應(yīng)結(jié)果Table2Resultsofcolourreaction試劑HCl-ZnHCl-Mg10%NaOHAlCl3MgAc2H2SO4化合物Ⅰ紫紅紅黃黃綠黃黃化合物Ⅱ紫紅紅黃黃綠黃黃顏色反應(yīng)結(jié)果表明，兩種黃酮類化合物均為黃酮醇類化合物。2.3紫外光譜分析化合物Ⅰ：淺黃色粉末晶體，在紫外光下有兩個特征吸收峰：364nm(Ⅰ)、268nm(Ⅱ)。在甲醇鈉存在條件下，帶Ⅰ紅移55nm，說明有C4’-OH；在AlCl3及存在AlCl3/HCl存在條件下，帶Ⅰ紅移55nm、帶Ⅱ紅移8nm，說明有C5-OH和C3-OH存在；在NaAc存在條件下，帶Ⅱ紅移9nm,說明有C7-OH存在；在NaAc/H3BO3存在條件下，帶Ⅰ紅移32nm、帶Ⅱ紅移9nm，說明B環(huán)有鄰二羥基存在，即分子中有C4’-OH和C化合物Ⅱ：黃色粉末晶體，在紫外光下有兩個特征吸收峰：361nm(Ⅰ)、258nm(Ⅱ)。在甲醇鈉存在條件下，帶Ⅰ紅移60nm，說明有C4’-OH；在AlCl3及AlCl3/HCl存在條件下，帶Ⅰ紅移63nm、帶Ⅱ紅移17nm，說明有C5-OH和C3-OH存在；在NaAc存在條件下，帶Ⅱ無紅移,說明沒有C7-OH存在，或C7-OH被取代對紫外吸收的貢獻消失；在NaAc/H3BO3存在條件下，帶Ⅰ、Ⅱ通過上述分析結(jié)果得知，利用水浴提取川楝黃酮正丁醇萃取物中含有黃酮醇類化合物，其基本結(jié)構(gòu)為：化合物Ⅰ化合物Ⅱ2.4抗氧化活性研究由圖1可知，化合物Ⅰ對O2-·和·0H的清除率隨濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達到0.5g/L時對O2-·的清除率達為69.57%，對·0H的清除率為74.19%；由圖2可知，化合物Ⅱ?qū)2-·和·0H的清除率隨濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達到0.5g/L時對O2-·的清除率為65.22%，對·0H的清除率為73.12(▲：O2-·；●：·0H)圖1化合物Ⅰ質(zhì)量濃度與O2-·和·0H圖2化合物Ⅱ質(zhì)量濃度與O2-·和·0H清除率的關(guān)系清除率的關(guān)系Fig.1EffectsofCompoundⅠonscavengingsFig.2EffectsofCompoundⅡonscavengingsO2-·and·0HO2-·and·0H3.結(jié)論3.1通過TLC法表明川楝子的提取液正丁醇萃取物中含有兩個化合物。根據(jù)顏色反應(yīng)表明兩個化合物均為黃酮醇類化合物。3.2紫外分析結(jié)果表明化合物Ⅰ含有C4’-OH、C5-OH、C3-OH、C7-OH、鄰二羥基（即C4’-OH和C3’-OH）；化合物Ⅱ含有C4’-OH、C5-OH、3.3利用過硫酸銨/N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，當(dāng)質(zhì)量濃度達到0.5g/L時，化合物Ⅰ對其清除率為69.57%；化合物Ⅱ?qū)ζ淝宄蕿?.4利用Fenton體系產(chǎn)生羥自由基，當(dāng)質(zhì)量濃度達0.5g/L時，化合物Ⅰ對其清除率為74.19%；化合