第二十章比色法和分光光度法20.1概述20.2光吸收定律20.3比色法和分光光度法及其儀器20.4顯色反應(yīng)與顯色條件選擇20.5分光光度法儀器測(cè)量誤差及消除20.6分光光度法應(yīng)用20.7熒光分光光度法比色法和分光光度法chapter第1頁(yè)20.1概述20.1.1分（吸）光光度法及其特點(diǎn)比色法：利用有色溶液顏色深度測(cè)定該溶液濃度。目視比色法：用肉眼直接比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色深淺。分光光度法：用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)量溶液吸光度。分光光度法特點(diǎn)：靈敏度高。10-3

－10-6mol/L。準(zhǔn)確度高。相對(duì)誤差2－5％。儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便。應(yīng)用范圍廣。比色法和分光光度法chapter第2頁(yè)20.1.2吸收光譜光譜區(qū)劃分微波遠(yuǎn)紅外近紅外可見光近紫外真空紫外X-射線-射線波長(zhǎng)1000um10um100nm10nm紅620－750nm橙590－620nm黃570－590nm綠550－570nm青495－550nm藍(lán)450－495nm紫380－450nm190－400nm比色法和分光光度法chapter第3頁(yè)2.可見光吸收光譜光互補(bǔ)色示意圖白光紅橙黃綠青青藍(lán)藍(lán)紫單色光：?jiǎn)我徊ㄩL(zhǎng)光復(fù)合光：復(fù)合波長(zhǎng)光互補(bǔ)光：處于同一直線上兩種光。互補(bǔ)光按一定強(qiáng)度百分比混合，即得白光。溶液顏色：互補(bǔ)光顏色。比色法和分光光度法chapter第4頁(yè)吸光度：某波長(zhǎng)光經(jīng)過(guò)含有紫外-可見光吸收物質(zhì)溶液后，被吸收光百分比。吸收光譜曲線：溶液對(duì)不一樣波長(zhǎng)光吸收強(qiáng)度，即以入射光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)所做一條曲線。最大吸收波長(zhǎng)：物質(zhì)對(duì)該波長(zhǎng)光吸收最大，即吸收光譜曲線上最大峰值。3.吸收光譜曲線透過(guò)率：某波長(zhǎng)光經(jīng)過(guò)含有紫外-可見光吸收物質(zhì)溶液后，沒有被吸收光（即透過(guò)光）百分比。比色法和分光光度法chapter第5頁(yè)四種川芎內(nèi)酯化合物紫外吸收光譜圖1-洋川芎內(nèi)酯H；2-洋川芎內(nèi)酯I；3-瑟丹酸內(nèi)酯；4-藁本內(nèi)酯比色法和分光光度法chapter第6頁(yè)

物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)分子軌道中價(jià)電子高速旋轉(zhuǎn)；原子在平衡位置振動(dòng)；分子本身轉(zhuǎn)動(dòng)。分子能量?jī)r(jià)電子能級(jí)能量＋振動(dòng)能級(jí)能量＋轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)能量能級(jí)差與對(duì)應(yīng)光譜價(jià)電子能級(jí)間能量差1-20eV，紫外-可見光能量；振動(dòng)能級(jí)間能量差0.05-1eV，紅外光能量；轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間能量差10-4-0.05eV，遠(yuǎn)紅外光及微波能量。4.物質(zhì)吸收光本質(zhì)比色法和分光光度法chapter第7頁(yè)

吸收光譜與發(fā)射光譜分子吸收能量后受到激發(fā)，分子就從基態(tài)能級(jí)躍遷到激發(fā)態(tài)能級(jí)，因而產(chǎn)生吸收光譜。處于激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)或能級(jí)較低激發(fā)態(tài)，就會(huì)以光子形式釋放能量，從而產(chǎn)生發(fā)射光譜。

紫外-可見吸收光譜分子中價(jià)電子吸收特定波長(zhǎng)光（紫外-可見光）后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。比色法和分光光度法chapter第8頁(yè)20.2光吸收定律朗伯（Lambert）定律：一束單色光經(jīng)過(guò)吸光物質(zhì)溶液后，光吸收程度（吸光度）與溶液液層厚度成正比。A為吸光度;I0為入射光強(qiáng)I為透過(guò)光強(qiáng);T為透光度k’為百分比常數(shù)b為液層厚度（光程長(zhǎng)度）bI0

I即：比色法和分光光度法chapter第9頁(yè)

比耳（Beer）定律：一束單色光經(jīng)過(guò)吸光物質(zhì)溶液后，光吸收程度與吸光物質(zhì)微粒（分子）數(shù)目（濃度c）成正比。即：

朗伯-比耳定律：

當(dāng)b單位為cm，c單位為mol/L時(shí)吸光系數(shù)稱摩爾吸光系數(shù)，其單位為cm-1mol-1L。大小與吸光物質(zhì)性質(zhì)、入射波長(zhǎng)和溫度相關(guān)。比色法和分光光度法chapter第10頁(yè)朗伯-比耳定律適用范圍：不但適合用于溶液，也適合用于均勻氣態(tài)吸光物質(zhì)和固態(tài)吸光物質(zhì)；它是各種吸光光度法定量分析依據(jù)。思索：摩爾吸光系數(shù)怎樣測(cè)定？比色法和分光光度法chapter第11頁(yè)工作曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）：測(cè)定信號(hào)大小隨被測(cè)物濃度改變曲線。要求這一曲線為直線，即測(cè)定信號(hào)與被測(cè)物濃度成正比。理想情況下工作曲線過(guò)原點(diǎn)；直線線性范圍是有限（高濃度端偏離）；通常要求兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上線性范圍；樣品中被測(cè)物濃度應(yīng)在工作曲線線性范圍內(nèi)。偏離比耳定律：即工作曲線在高濃度端發(fā)生偏離。比色法和分光光度法chapter第12頁(yè)偏離比耳定律原因：比爾定律本身不足。比爾定律假設(shè)了吸光分子之間無(wú)相互作用，實(shí)際上，高濃度時(shí)分子間相互作用不可忽略。入射光為非單色光時(shí)偏離。儀器分光元件（單色器）極難得到真正單色光，而是波長(zhǎng)范圍很窄復(fù)合光帶，而比耳定律僅在入射光為單色光時(shí)才是正確?；瘜W(xué)原因引發(fā)偏離。其一是介質(zhì)不均勻（膠體、乳濁液、懸浮液）而產(chǎn)生折射、散射和反射，使透過(guò)光強(qiáng)減弱（A增大）。其二是吸光分子發(fā)生化學(xué)改變而改變濃度。比色法和分光光度法chapter第13頁(yè)20.3比色法和分光光度法及其儀器1.光度分析方法目視比色法：光電比色法：用光電比色計(jì)測(cè)定未知溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。光電比色計(jì)用濾光片得到較窄波長(zhǎng)范圍入射光；分（吸）光光度法：用分光光度計(jì)測(cè)定未知溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。分光光度計(jì)用棱鏡或光柵做分光元件得到單色入射光。比色法和分光光度法chapter第14頁(yè)2.分光光度計(jì)基本部件光源單色器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示光源：在可見和近紅外區(qū)使用鎢燈或碘鎢燈，波長(zhǎng)范圍320-2500nm；在紫外區(qū)使用氫燈或氘燈，波長(zhǎng)范圍180-375nm。

使用穩(wěn)壓器確保光強(qiáng)穩(wěn)定。比色法和分光光度法chapter第15頁(yè)單色器：色散元件：將連續(xù)光譜分解為單色光元件（如棱鏡、光柵）；單色器：由入射狹縫、準(zhǔn)直透鏡、色散元件、聚焦透鏡和出射狹縫組成。玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱鏡僅用于350-3200nm波長(zhǎng)范圍，只能用于可見分光光度計(jì)；石英（185-4000nm）則可用于整個(gè)紫外-可見光區(qū)。光柵利用光衍射與干涉作用，其優(yōu)點(diǎn)是適用波長(zhǎng)范圍寬、色散均勻、分辨率高；但其缺點(diǎn)是各級(jí)光譜有重合而產(chǎn)生相互干擾。比色法和分光光度法chapter第16頁(yè)吸收池（比色池、比色皿）：用無(wú)色透明、耐腐蝕光學(xué)玻璃或石英制造。因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。杯差：一對(duì)比色池對(duì)光吸收差異，試驗(yàn)前要先校杯差。檢測(cè)系統(tǒng)：光電轉(zhuǎn)換元件（硒光電池、光電二極管）。結(jié)果顯示部分：直接顯示出測(cè)定結(jié)果數(shù)值（吸光度、透過(guò)率等）。比色法和分光光度法chapter第17頁(yè)20.4顯色反應(yīng)與顯色條件選擇顯色反應(yīng)：將無(wú)色或吸光系數(shù)很小被測(cè)物與顯色劑反應(yīng)，使之轉(zhuǎn)變成含有較強(qiáng)UV或Vis吸收化合物后測(cè)定。顯色劑：能與被測(cè)物反應(yīng)，并使之顯（顏）色試劑。無(wú)機(jī)顯色劑（硫氰酸鹽、鉬酸銨、雙氧水等）與被測(cè)物生成有色物穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性都不高，應(yīng)用較少。有機(jī)顯色劑（磺基水楊酸、二苯硫腙等）大多能與金屬離子形成穩(wěn)定有色配（螯）合物。比色法和分光光度法chapter第18頁(yè)生色基團(tuán)舉例：碳碳三鍵：max=175nm，躍遷；碳碳雙鍵：max=190nm，躍遷；苯：max=254，250，204nm，躍遷；羧基：max=204nm，n躍遷；生色基團(tuán)：分子吸收紫外-可見光與其分子結(jié)構(gòu)相關(guān)；紫外-可見吸收光譜包括電子躍遷是：

n（非鍵軌道），n和。比色法和分光光度法chapter第19頁(yè)對(duì)顯色反應(yīng)要求：含有較高靈敏度。摩爾吸光系數(shù)103－105；有很好選擇性；生成顯色物（多為螯合物）穩(wěn)定、組成恒定；產(chǎn)物顏色應(yīng)與被測(cè)物顏色有較大差異；顯色條件應(yīng)易于控制。萃取光度法：當(dāng)顯色劑與被測(cè)物（通常是金屬離子）生成有色物在有機(jī)溶劑中有很好溶解度時(shí)，能夠讓水相中生成有色物萃取到有機(jī)相，用有機(jī)相進(jìn)行光度分析。比色法和分光光度法chapter第20頁(yè)顯色條件選擇：顯色劑用量。酸度。酸度可能會(huì)影響顯色劑濃度、顯色劑顏色、配合物組成和被測(cè)離子存在狀態(tài)。顯色溫度。顯色時(shí)間。溶劑種類。很多顯色配合物只在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定。干擾防止與消除。比色法和分光光度法chapter第21頁(yè)20.5分光光度法儀器測(cè)量誤差及消除測(cè)定波長(zhǎng)選擇：普通情況下選擇顯色配合物最大吸收波長(zhǎng)；為防止干擾，有時(shí)也選擇干擾小非最大吸收波長(zhǎng)。比色池選擇：通常使用1cm比色池；依據(jù)樣品濃度和顯色配合物靈敏度高低，能夠選取其它厚度比色池。比色法和分光光度法chapter第22頁(yè)目標(biāo)是消除池壁、溶劑、反應(yīng)試劑等對(duì)入射光反射和吸收所帶來(lái)系統(tǒng)誤差；只有被測(cè)產(chǎn)物有吸收，其它反應(yīng)試劑均無(wú)吸收時(shí)，可用純?nèi)軇┳鰠⒈?；顯色劑或其它試劑有顏色時(shí)，用試劑空白做參比；假如干擾物質(zhì)也生成類似顯色產(chǎn)物，也可按下法制備一個(gè)參比溶液：在顯色之前先將被測(cè)物掩蔽起來(lái)，只讓干擾物質(zhì)顯色，該空白溶液做參比便可消除干擾。參比溶液選擇：比色法和分光光度法chapter第23頁(yè)20.6分光光度法應(yīng)用1.應(yīng)用范圍既直接用于有色物測(cè)定，也經(jīng)過(guò)顯色用于無(wú)色物分析；既用于常量分析（>1%），也用于微量分析（0.01-1%）;既用于無(wú)機(jī)離子分析，也用于有機(jī)物分析；既用于定量分析，也可用于定性分析（特征吸收光譜、功效基團(tuán)特征吸收峰）；可用于其它領(lǐng)域研究（如化學(xué)平衡）；當(dāng)前環(huán)境等領(lǐng)域很多標(biāo)準(zhǔn)分析方法依然采取光度法。比色法和分光光度法chapter第24頁(yè)2.單組分測(cè)定通常在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，采取標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。3.多組分測(cè)定吸收光譜不重合時(shí)，可在各自最大吸收波長(zhǎng)下分別測(cè)定。吸收光譜單向重合，即組分1干擾組分2，而組分2不干擾組分1測(cè)定，這時(shí)只能直接測(cè)定組分1含量，要測(cè)定組分2含量，必須先用組分1標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定出組分1在組分2測(cè)定波長(zhǎng)下摩爾吸光系數(shù)，并用已測(cè)定出組分1濃度，計(jì)算波長(zhǎng)2下組分1吸光度，并從波長(zhǎng)2下組分1和2總吸光度中扣除組分1吸光度。吸光度雙向重合。需解聯(lián)立方程。比色法和分光光度法chapter第25頁(yè)3.差示分光光度法分光光度法測(cè)定時(shí)，吸光度讀數(shù)通常要求在0.2-0.8范圍內(nèi)，誤差最小是A=0.434。當(dāng)測(cè)定濃度比較大樣品時(shí)，因?yàn)槲舛茸x數(shù)超出準(zhǔn)確讀數(shù)范圍，會(huì)產(chǎn)生很大影響。差示分光光度法：用比樣品濃度略低標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比代替普通情況下試劑空白參比，使測(cè)定吸光度數(shù)值在0.2-0.8范圍內(nèi)。比色法和分光光度法chapter第26頁(yè)4.配合物組成測(cè)定摩爾比法：固定金屬離子濃度[M]，改變配體濃度[L]，在小于配合物組成比時(shí)，伴隨[L]/[M]比值最大，形成配合物濃度最大，溶液吸光度增加，到達(dá)配合物組成比之后，再增加[L]，即增加[L]/[M]比值，形成配合物濃度已基本變，從吸光度A與[L]/[M]關(guān)系曲線即可求得配合物摩爾組成比。A[L]/[M]121比色法和分光光度法chapter第27頁(yè)20.7熒光分光光度法光致發(fā)光現(xiàn)象：一些物質(zhì)分子受到電磁輻射照射時(shí)，能發(fā)射出相同波長(zhǎng)和更長(zhǎng)波長(zhǎng)光。熒光是光致發(fā)光一個(gè)。熒光現(xiàn)象：物質(zhì)吸收波長(zhǎng)較短光后，發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)光。可見（分子）熒光：物質(zhì)吸收波長(zhǎng)較短紫外光后，發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)可見熒光。熒光分析法（熒光分光光度法）：利用分子熒光現(xiàn)象，測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而測(cè)定熒光物質(zhì)或非熒光物質(zhì)（衍生化）。比色法和分光光度法chapter第28頁(yè)熒光分析法原理分子吸收光而被激發(fā)，使電子從基態(tài)上升至激發(fā)態(tài)，處于某一振動(dòng)狀態(tài)；分子碰撞而失去振動(dòng)能量，急劇降低至激發(fā)態(tài)中最低振動(dòng)能級(jí)；電子從激發(fā)態(tài)中最低振動(dòng)能級(jí)；躍遷回基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，并以光形式釋放能量，此光即為熒光。基態(tài)激發(fā)態(tài)無(wú)輻射躍遷熒光發(fā)射光譜熒光光譜能級(jí)躍遷圖能級(jí)吸收振動(dòng)能級(jí)比色法和分光光度法chapter第29頁(yè)熒光分析法特點(diǎn)：靈敏度高。比UV-Vis高約3個(gè)數(shù)量級(jí)。選擇性好。首先能發(fā)生熒光物質(zhì)少，且發(fā)生熒光物質(zhì)還必須吸收一定頻率光（激發(fā)），即使不一樣物質(zhì)都吸收了特定頻率光，不一樣物質(zhì)發(fā)出熒光波長(zhǎng)也不一定相同。方法簡(jiǎn)便、快速。應(yīng)用范圍窄。這是因?yàn)槟墚a(chǎn)生熒光物質(zhì)很有限。比色法和分光光度法chapter第30頁(yè)實(shí)例1：熒光分析法測(cè)定鄰-與間-羥基苯甲酸鄰-

與間-羥基苯甲酸均含有能發(fā)射熒光苯環(huán)，但取代基位置不一樣使它們含有不一樣熒光性質(zhì)；堿性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光激發(fā)下均發(fā)生熒光，而在中