第四章

抗體制藥

單克隆抗體技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)

分子克隆克隆技術(shù)細胞克隆

動物克隆重組DNA技術(shù)蛋白質(zhì)工程技術(shù)

生物傳感器組織工程技術(shù)生物芯片技術(shù)生物信息學(xué)技術(shù)生物技術(shù)的范圍雜交技術(shù)生物制藥研究的幾個熱點領(lǐng)域抗體藥物研究組合生物合成技術(shù)研究血管抑制劑抗腫瘤藥物研究功能基因組學(xué)研究EGF第一節(jié)概述

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進行定向治療。第二節(jié)單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的。雜交瘤技術(shù)的實驗原理及其操作演示

接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡——短命細胞一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性：B淋巴細胞(Blymphocytes)：骨髓瘤細胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活——長命細胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞株——沒有抗體分泌物。2.細胞融合技術(shù)：脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎3.雜交瘤細胞的篩選：脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞脾細胞/脾細胞骨髓瘤細胞/骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞脾細胞篩選出不能長期存活不能長期存活HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)二、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動物免疫：目的：在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞.特定目標抗原動物免疫脾臟中B淋巴細胞B淋巴細胞大量增殖刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：“穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時；省抗原”“省時”“操作繁瑣”常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原+不加佐劑第4次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)二、細胞融合及HAT篩選病毒介導(dǎo)的細胞融合PEG介導(dǎo)細胞融合電激融合1、細胞融合方法：細胞懸液的制備與融合(1)脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數(shù)生長期制備(3)細胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater三、抗體的檢測要求：簡便、快速、敏感;

在短時間內(nèi)能檢測大量樣品常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴散法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標儀檢測技術(shù)原理：四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法80個細胞/96孔飼養(yǎng)細胞(feedercells)ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的抗體，只針對于一個抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點：高度純一高度專一應(yīng)用：疾病的論斷和治療(生物導(dǎo)彈)生物大分子的鑒定、定位和分離純化細胞器的鑒定、定位和分離特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)罐法培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動物免疫細胞融合混合細胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞X抗原B淋巴細胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細胞死亡無限生長細胞分泌X抗體只有雜交瘤細胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解洗脫液支持物被分離物質(zhì)被分離物的抗體其它物質(zhì)親合層析原理圖解一、抗原與動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。

為使雜交瘤細胞穩(wěn)定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動物也采用相應(yīng)的品系。

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強、抗原量較多時應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細胞分裂。脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10μg。

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。體外免疫法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5～5μg/ml,在5%CO37C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細胞,進行細胞融合。o2o二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)細胞融合的方法：脾細胞（1×10）骨髓瘤細胞（2×10）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。87

用于細胞融合的骨髓瘤細胞應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體能力強，長期穩(wěn)定。PEG相對分子量4000，濃度為50%二甲基亞砜增加融合率。細胞融合后可產(chǎn)生多種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細胞。選擇性培養(yǎng):培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻斷DNA合成。三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。克隆化是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標，了解分泌抗體的能力。單抗進行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。親和力、特異性、純度、分子量測定。五、單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲的5～20mg/ml抗體用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細胞取腹水離心上清。六、單克隆抗體的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。第三節(jié)鼠源性單克隆抗體

的改造雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。

目的：

降低免疫源性；降低相對分子量。方式：

鼠源MCAb的Ｃ區(qū)被人Ｉｇ的Ｃ區(qū)置換（人-鼠嵌合抗體、改形抗體）只克?。謪^(qū)基因，使其表達（小分子抗體）Ig分子結(jié)構(gòu)FabFvIg分子的基因結(jié)構(gòu)一、人鼠嵌合抗體抗原抗體結(jié)合功能—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，就能表達完整人-鼠嵌合抗體。二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。H和L鏈各有三個CDR，其它部分稱框架區(qū)。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。問題：改形抗體親和力下降，甚至活性喪失．由于Ｉｇ分子中一些氨基酸與鼠Ｉｇ的CDR不協(xié)調(diào)解決方法：摸板替換，表面重塑，補償變換，定位保留三、小分子抗體基因工程小分子抗體僅表達鼠源單抗的V區(qū)片段，相對分子量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體（VH+CH1）-(VL+CL)②Fv抗體VH+VL非共價結(jié)合

③單鏈抗體（SCFV）VH+VLLinker連接而成的單鏈重組蛋白特點：高親和力，低分子量，穿透力強，免疫原性小，易與效應(yīng)分子連接④單域抗體VHorVL表面疏水性強，與抗原非特異作用強⑤最小識別單位（MRU）單個CDR親和力低，實際應(yīng)用局限性大單鏈抗體的應(yīng)用優(yōu)點：①可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景更加清晰