大提質(zhì)粒單菌落接種到5ml含抗生素的LB培養(yǎng)液中（試管體積應(yīng)比培養(yǎng)液至少大4倍；試管不應(yīng)蓋得太緊；轉(zhuǎn)速應(yīng)很劇烈）。當(dāng)OD600=0.6時(shí)倒入含抗生素的250mlLB培養(yǎng)液，37°C300r/min培養(yǎng)約14-18h。4,000rpm,10min,4C收集細(xì)胞。去上清，加solutionI8ml,渦旋振蕩重懸（4C）至溶液均勻無塊狀菌團(tuán)。每管加入solutionII16ml輕柔上下顛倒20下徹底混勻，置冰上5min（時(shí)間不可過長(zhǎng)）。每管加入solutionIII8ml（4C）,立即輕柔地上下顛倒，徹底混勻，使沉淀均勻混于溶液中，呈現(xiàn)絮狀而非團(tuán)狀，冰上放置10min。平衡后，4C，12,000rpm,20min。將上清經(jīng)兩層神奇濾布（DDW潤(rùn)洗）過濾至新50ml離心管中（約30ml）加入0.6V（約18ml）異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫，30min。平衡后，室溫，12,000rpm,20min。小心棄上清，離心管敞開蓋，倒置以去殘余上清。室溫下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，倒置去凈乙醇，待揮發(fā)無味后（不要太干燥）加入總量4.2mlDDW[or6.2ml】。轉(zhuǎn)入15ml瘦型離心管中，加入CsCl6g[or8g】（終濃度1g/ml），EB120^l[or160^l】（母液濃度10mg/ml）。緩慢加入超速離心管6ml【or8ml】，管內(nèi)要裝滿，不能有氣泡，精確配平（精確值0.01g）。超速離心60,000rpm（~250,000g），16h，20C。升速調(diào)至次最快，降速調(diào)至nobrake。收集閉環(huán)條帶：用10ml注射器針頭在離心管頂端扎一個(gè)小孔；將10ml的一次性注射針器針頭斜面向上插入閉合環(huán)下方約1cm處，針頭的斜面開口正好位于較低的DNA區(qū)帶（閉環(huán)質(zhì)粒DNA）下方；緩慢吸出質(zhì)粒DNA，小心不要攪動(dòng)上方粘稠的染色體DNA區(qū)帶。取等體積SSc飽和異戊醇上層加入離心管，反復(fù)上下顛倒混勻，靜置5-10min，吸除上層含有EB的有機(jī)相，重復(fù)10次左右，直至溶液不含紅色EB。最后一次抽提可靜置60-90min【通風(fēng)櫥中操作】。吸300皿質(zhì)粒溶液入進(jìn)口Ep管，加入1.2ml（4V）70%乙醇顛倒混勻，沉淀質(zhì)粒，室溫，＞30min。小離心機(jī)，13,000rpm,15min，室溫。加入600^l，70%乙醇洗一次，13,000rpm，3min，室溫。倒掉酒精，甩一下，用槍吸除剩余液體，放置5min，呈半透明狀，加DDW200皿（依量而定）溶解。稀釋10倍或100倍，取2皿NANODrop測(cè)定濃度，再取500ng跑電泳。List：Solution1：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl（pH8.0）/10mMEDTA（pH8.0）；4°C存放TOC\o"1-5"\h\z100ml葡萄糖（Glc）0.9908g1MTris?Cl2.5ml0.5MEDTA2.0mlSolution2：0.2NNaOH/1%（m/V）SDS；（配10NNaOH,S2要現(xiàn)配，先加水）100ml10NNaOH2ml10%SDS10mlSolution3（4C存放）100ml5M乙酸鉀60.0ml（MW=98.14g/mol,or直接稱取29.442g乙酸鉀固體）；冰乙酸11.5mlH2O28.5ml；異丙醇isopropanol；CsCl（固體）；EtBr（10mg/ml）；石蠟油SSc飽和異戊醇20xSSc：800mlDDW溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，用幾滴14mol/L濃鹽酸調(diào)pH值=7，用水定容至1L,分裝（分在兩瓶）后高壓滅菌。SSc飽和異戊醇：200ml20xSSc與300ml異戊醇充分顛倒混勻，室溫靜置分層（放置過夜，提前準(zhǔn)備）。使用時(shí)吸取上層。70%乙醇LB培養(yǎng)基（每瓶250ml）神奇濾布，離心瓶（兩種：離心菌的，沉淀DNA的）冰10ml注射器若干提前預(yù)約超速離心機(jī)擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（所有藥品均為進(jìn)口）1.打開水浴鍋，TM=55°C2,配10ml酶解液（8種試劑），置于培養(yǎng)皿中【10ml酶解液，40片葉子，約產(chǎn)出3x106protoplasts】酶解液（8種試劑）【現(xiàn)配】40ml10ml15mlCelluloseR100.6g（不要粘在管壁上）0.15g0.225gMacrozymeR100.16g0.04g0.06g0.8MMannitol20ml5ml7.5ml2MKCl0.4ml100pl150pl1MMES0.8ml200pl300pl55oC,10min（嚴(yán)格，前邊搖2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用搖），待酶液自然降至室溫，加入0.4mL【10ml-100|il；15ml-150|il】1MCaCl2母液以及18.4mL【10ml-4.6ml；15ml-6.9ml】DDW（補(bǔ)足40ml），0.04gBSA【10ml-0.01g；15ml-0.015g】，最終酶液應(yīng)為清亮棕色溶液，0.45pm濾膜過濾。將0.4Mmannitol滴至一次性培養(yǎng)皿上，將葉片切成細(xì)絲，一刀一刀斷開切，忌來回蹭。23oC避光酶解2h（或3h，放置時(shí)間較長(zhǎng)的酶液），40rpm。收獲前75rpm，搖1min。配PEG【至少轉(zhuǎn)化前1h配制，以便PEG完全溶解，室溫放置】，提前將BD50ml離心管置冰上。PEG【最好現(xiàn)配，不滅菌】5mlPEG40002g0.8MMannitol1.25ml1MCaCl20.5mlDDW1.5ml用等體積W5稀釋酶/原生質(zhì)體溶液，尼龍膜（W5潤(rùn)洗）過濾至50ml離心管收集原生質(zhì)體，100g，3min，23C，升速3，降速3離心用5ml大槍頭吸除酶液，原生質(zhì)體多則把酶液吸凈，少則留一點(diǎn)酶液，加入10-20mlW5（依量而定）洗滌。100g，3min，23C，升速3，降速3離心吸去上清，再加入20mlW5,輕搖離心管重懸原生質(zhì)體。冰上30min，鏡檢，Hemacytometer血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。100g，3min，23C，升速3，降速3離心。吸凈W5上清，加入2-3mlMmg重懸，使原生質(zhì)體濃度達(dá)到1.5-2x106ml-1，冰上放置。加15pg質(zhì)粒DNA至2ml離心管中，沿管壁緩慢加入150pl原生質(zhì)體溶液【每次取的時(shí)候重懸混勻原生質(zhì)體】，輕輕充分吹打混勻。立即緩慢加入150plPEG溶液，呈兩層，輕柔顛倒充分混勻，不要有PEG溶液一點(diǎn)一點(diǎn)，而應(yīng)是充分均勻的溶液。加完P(guān)EG后每管室溫放置8-15min。（PEG剛加入時(shí)要分層，否則轉(zhuǎn)化效率不高）。［大反應(yīng)：取50ml離心管，每管加入120pg質(zhì)粒/每一種，然后用槍吸打混勻，陰性對(duì)照加一種質(zhì)粒，然后用水補(bǔ)齊使總體積一致，然后用槍吸打混勻。冰上放置。50ml離心管中加入3ml原生質(zhì)體溶液，沿管壁緩慢加入，充分搖勻。每次室溫?fù)u勻后隨即每50ml離心管

加入3mlPEG溶液，輕柔顛倒混勻，不要有PEG溶液一點(diǎn)一點(diǎn)，而應(yīng)是充分均勻的溶液。加完P(guān)EG后每管室溫放置8-15min。］好的情況下，此時(shí)不應(yīng)看見有沉渣。加入赤1室溫W5【W(wǎng)5沿管壁輕緩流入管底】，馬上輕輕顛倒混勻，終止反應(yīng)。蓋子一定不要蓋得太緊，100g，3min，23°C，升速3，降速3離心。吸除上清，留約100^1，再加入1mlW5，100g，3min，23C，升速3，降速3離心。吸除上清，再加入1-2m1W5,重懸原生質(zhì)體，置于12孔板中，室溫，放置于白色白熾燈下，液體不要粘在蓋子上，用一張白紙遮蓋?。ü獠灰珡?qiáng)），放約12-18h。注意事項(xiàng)：3-4周的未經(jīng)移苗的植物：取剛剛完全展開，葉面光滑，非凹凸不平的，最上面最中間的葉片，依次向下選取，取瘦長(zhǎng)的，葉緣尖銳的葉片為佳，以第5-7片真葉為佳。每四棵苗取8-10片葉子。每次做大反應(yīng)（用于CO-IP）最多做8管，每管需3ml原生質(zhì)體溶液，濃度為106，10ml酶液需40片葉子。小反應(yīng)用于做蛋白定位，每管需200pl原生質(zhì)體溶液，20瞄質(zhì)粒。提出原生質(zhì)體后每一步都要?jiǎng)幼鬏p緩，以免原生質(zhì)體破裂，操作間隙置冰上。100mlW5【室溫保存】1MMESMCaCl2MKClNaClDDW200pl1MMESMCaCl2MKClNaClDDW12.5ml250pl0.9009gaddto100ml20mlMMG【室溫保存】1MMES80pl0.8MMannitol10ml1MMgCl2300plDDWaddto20mlList：水浴鍋，搖床，冰，0.4Mmannitol0.45pm（or0.22pm）濾膜，培養(yǎng)皿，量筒，刀，75pm尼龍膜，錫箔紙，計(jì)時(shí)器，彎頭鑷子（用于撕葉片下表皮）顯微鏡，移液器，移液管