關于蛋白質分子基礎蛋白質制備第1頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的電泳第2頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的電泳分離電泳分離的原理:

蛋白質是兩性電解質,在一定的pH下,可以解離為帶電荷的離子。在電場中可以電泳移動。電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的快慢，用電泳遷移率(M)表示：

M為遷移率；dL為顆粒移動的距離；L為通電的時間。E為兩個電極之間的電勢差。M=EtdL第3頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第4頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六影響蛋白質電泳遷移率的因素蛋白質分子的性質。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第5頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第6頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六影響蛋白質電泳遷移率的因素蛋白質分子的性質。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第7頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第8頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六影響蛋白質電泳遷移率的因素蛋白質分子的性質。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第9頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。離子強度增強，緩沖液所載的分電流隨之增加，樣品所載分電流降低，樣品電泳速度變慢離子強度太低，電導率太小，樣品移動緩慢第10頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六影響蛋白質電泳遷移率的因素蛋白質分子的性質。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第11頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六電泳的類型自由界面電泳使用支持物的區(qū)帶電泳。

區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質上或支持介質中遷移。支持介質的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。第12頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六聚丙烯凝膠電泳SDS凝膠等電聚焦第13頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六SDS電泳在蛋白質中加入摩爾比為1.4：1(SDS:蛋白質)的SDS(十二烷基硫酸鈉)。使所有蛋白質都帶上負電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質的疏水部分結合，并且把大部分蛋白質拆成組成他的亞基形式。在上樣緩沖液中加入巰基乙醇，可以使二硫鍵還原為巰基。使不同的蛋白質分子的短軸一致，長軸與蛋白質的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質電泳的速度不再取決于蛋白質的電荷與形狀，只與蛋白質的分子量有關。第14頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第15頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第16頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六SDS電泳當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logM=K-bX

M為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。第17頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六SDS電泳繪制標準曲線：

按下式計算相對遷移率：

以每個蛋白標準的分子量對數對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。第18頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六SDS電泳PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中,由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。第19頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六不連續(xù)SDS各部分凝膠配制電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。第20頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第21頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第22頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第23頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六Figure6.2.4SDSresultsoffractionS1(SRA)兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白

MW=66,200兔肌動蛋白

MW=43,000牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制劑

MW=20,100雞蛋清溶菌酶

MW=14,400第24頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六SDS應注意的幾個問題制備凝膠時，TEMED要加膠之前再加。電泳之前蛋白質要溶解在含1%的SDS和1%的巰基乙醇的磷酸緩沖液(0.01mol/L,pH7.2),1000C加熱2~5分鐘。如凝膠中含有雜質，可以在加入樣品前先預電泳0.5~1小時。SDS與蛋白質分子結合后，蛋白質分子的構象發(fā)生變化，解離為亞單位，電泳結果顯示的只是亞單位的大小，同時蛋白質也會失去原來的活性。已發(fā)現有些蛋白質不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑嬒螽惓５牡鞍踪|，帶有較大輔基的蛋白質（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。第25頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六等電聚焦電泳

蛋白質是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質的等電點。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質從而構成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。第26頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六等電聚焦電泳根據要分離的蛋白質的pI的不同，訂購不同pH梯度的凝膠，可以對蛋白質樣品進行分離。

如3.5~9.5、2.5~6.0、5.0~8.5、7.5~10等。凝膠的pH值范圍越窄，分辨力越高?？煞蛛x等電點相差0.01個pH單位的蛋白質，最高可以分辨0.0025個pH單位的蛋白質。等電凝膠可以抵消擴散作用，蛋白質可以富集在很窄的區(qū)帶上。適用于少量蛋白質樣品的分析鑒定，不適用于大量制備。要求用無鹽的溶液，而蛋白質在無鹽溶液中容易沉淀；在等電點發(fā)生沉淀和變性的蛋白質也不適合用次方法分離。第27頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第28頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第29頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六pI的測定可以用染色法觀察蛋白質，然后用表面電極直接測量pH值?；驅⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝膠塊并且測量pH。第30頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結合便得到高分辨率的蛋白圖譜。1975年，O’Farrell首先運用雙向電泳技術將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白質組學的發(fā)展，雙向電泳技術越來越廣泛的用于發(fā)現未知蛋白。第31頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第32頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六第33頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六PAGE電泳分離的大分子的檢測考馬斯亮藍染色法

可檢出0.3~1ug的蛋白質。銀染色法銀離子與蛋白質以鹽或配價絡鹽的形式結合，用甲醛將銀離子還原為可見的銀顆粒?？蓹z測ng水平的蛋白質。熒光染色技術熒光合成物質與PAGE上的蛋白質發(fā)生反應，發(fā)出強烈的熒光，可檢測到PAGE中的蛋白質。第34頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六免疫印跡法蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。具體操作為經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。第35頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六免疫印跡法抗原包被的實驗膜條

特異性人抗體標記的二抗標記第36頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六免疫印跡法第37頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的結晶第38頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的結晶可以作為蛋白質提純的方法之一。蛋白質純度達到一定值時可以結晶。通過反復重結晶可以除去其中的雜質，使蛋白質得到更大程度的純化。蛋白質結晶體是比較穩(wěn)定的結構，所以結晶可以作為一個穩(wěn)定的儲存的方法。在蛋白質結晶之后，可以提供作X射線衍射分析用的材料，來分析蛋白質的結構等數據。第39頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質結晶的原理蛋白質溶液在合適的過飽和狀態(tài)，溶質分子通過擴散、旋轉、碰撞等運動形式，可以形成晶核。溶質分子以相互碰撞的作用方式有序而反復地堆砌在晶核上，直到晶核成長到晶體，最后從溶液中析出。第40頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六晶體結晶的條件蛋白質純度越高，結晶越容易，至少要在50%以上。蛋白質濃度。濃度越高，結晶機會越大。但過大會因雜質存在而導致晶形不好。一般結晶的蛋白質濃度在10~50mg/mL。溫度。蛋白質結晶溫度在0~400C。一般在40C冷室或250C溫箱中進行。pH。一般在蛋白質的等電點的pH附近結晶。金屬離子和離子強度。一些二價離子可以引起或有利于蛋白質的結晶過程。沉淀劑。沉淀劑(如鹽類和各種有機溶劑)可改變蛋白質的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇(PEG)和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。第41頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質結晶方法鹽析法在蛋白質溶液中加入鹽，使蛋白質溶解度降低，之后以結晶形式從溶液中析出。有機溶劑法有機溶劑可以使蛋白質介電常數降低，導致蛋白質結晶析出。等電點結晶。蛋白質在等電點時溶解度最小，可以形成結晶。脫鹽結晶。一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶于鹽溶液的蛋白質結晶而出，然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對溫度敏感的蛋白質，不同溫度溶解度變化大?？蛇\用此法。金屬離子。在某些蛋白質溶液中加入金屬離子，可以促進晶體的形成。第42頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質提純過程中的定量第43頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的定量(1)定氮法測量蛋白質含量蛋白質含量（克%）

=每克生物樣品中含氮的克數

6.25第44頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的定量(2)雙縮脲法第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。

雙縮脲試劑的成分是質量濃度為0.1g/mL的氫氧化鈉溶液和質量濃度為0.01g/mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡合物,這個反應叫做雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵,因此,含兩個或亮個以上的肽鍵化合物尤其是蛋白質都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應。第45頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六雙縮脲反應產物可在540nm處進行比色測定可以測定蛋白質的含量，可測定范圍為0.1~1.0mg/mL。

！此反應為肽及蛋白質特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應。第46頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的定量(3)福林-酚試劑法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應，生成藍色化合物，在600nm下測光吸收?？筛鶕y得的標準曲線計算出蛋白質的含量。靈敏度較高，可達25g-250g/ml。靈敏度比280nm處的紫外吸收法靈敏10倍，比雙縮脲法靈敏100倍。

第47頁，共55頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質的定量(4)紫外吸收法A.280nm光吸收法

根據得到的280nm的光吸收值與蛋白質的濃度正比，可以測量蛋白質溶液中的濃度。B.280nm和260nm的吸收差法用280nm下的紫外吸收減去260nm下的紫外吸收，可以排除260nm下由于核酸吸光帶來的干擾。蛋白質濃度(mg/mL)