1深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷北京朝陽(yáng)醫(yī)院

谷麗1深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷北京朝陽(yáng)醫(yī)院谷麗12教師簡(jiǎn)介

畢業(yè)于北京協(xié)和醫(yī)院，獲呼吸內(nèi)科醫(yī)學(xué)

博士學(xué)位。2012-2013年于美國(guó)西北大

學(xué)醫(yī)學(xué)院做訪問(wèn)學(xué)者一年

首都醫(yī)科大學(xué)朝陽(yáng)醫(yī)院感染和臨床微生

物科副主任

中華醫(yī)學(xué)會(huì)北京感染分會(huì)委員

從事感染性疾病臨床和科研工作，包括

呼吸道感染、復(fù)雜泌尿系感染、中樞神

經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、皮膚軟組織感

染、免疫缺陷（器官移植術(shù)后、激素和

免疫抑制劑應(yīng)用后）繼發(fā)感染，以及復(fù)

雜性不明原因發(fā)熱等

貼照片處（照片尺寸9.4×6.8cm）

谷麗

主任醫(yī)師2教師簡(jiǎn)介畢業(yè)于北京協(xié)和醫(yī)院，獲呼吸內(nèi)科醫(yī)學(xué) 貼照片處23導(dǎo)讀疾病常伴有真菌感染，病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷非常重要，而真菌診斷仍面臨挑戰(zhàn)。臨床常用的診斷方法有直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、結(jié)合抗原抗體。臨床醫(yī)生需要結(jié)合臨床＋影像＋微生物證據(jù)來(lái)確診并給予合適的治療3導(dǎo)讀疾病常伴有真菌感染，病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷非常重要，而34學(xué)習(xí)目標(biāo)深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法掌握每種診斷方法的臨床應(yīng)用4學(xué)習(xí)目標(biāo)深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法45內(nèi)容概況真菌感染基本概念

致病性分類(lèi)

形態(tài)分類(lèi)

致病途徑實(shí)驗(yàn)室診斷方法及臨床應(yīng)用

直接鏡檢

真菌培養(yǎng)

抗原抗體檢測(cè)

分子診斷（PCR）臨床病例分享5內(nèi)容概況真菌感染基本概念致病性分類(lèi)實(shí)驗(yàn)室診斷方法及56按照真菌致病性的分類(lèi)

原發(fā)致病性真菌

致病性真菌本身具有很強(qiáng)的致病性，可使免疫正

常宿主致病如：組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西

副球孢子菌、皮炎芽生菌著色真菌、足分支菌、

孢子絲菌等

多呈地區(qū)性流行－南北美洲

條件致病性真菌－占主要地位，呈上升趨勢(shì)

正常情況下不致病，在特定條件能引起疾病，通

常是在機(jī)體的局部或全身免疫功能降低病菌寄居

部位的改變6按照真菌致病性的分類(lèi)原發(fā)致病性真菌致病性真菌本身具67按照真菌生長(zhǎng)的形態(tài)分類(lèi)

霉菌（molds）：多細(xì)胞真菌，包含分支的管狀結(jié)構(gòu)——菌

絲環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，形成菌絲體，如曲菌、毛霉菌。繁殖方式：

孢子形成

酵母菌（yeasts）：?jiǎn)渭?xì)胞真菌，呈圓形或卵圓形，如新型

隱球菌以出芽方式進(jìn)行繁殖。有些可以形成假菌絲（如白色

念珠菌）

雙相真菌（dimorphicfungi）：可以酵母菌和霉菌兩種形式

存在。環(huán)境中以霉菌形式生長(zhǎng)，孢子入侵人體后，以酵母菌

樣形式生長(zhǎng)。如組織胞漿菌

、馬尼菲青霉菌

37

°C

–酵母相

27

°C

–菌絲相煙曲霉菌酵母菌7按照真菌生長(zhǎng)的形態(tài)分類(lèi)煙曲霉菌酵母菌78致病途徑真菌在自然界廣泛存在：吸入空氣中的真菌孢子可引起支氣管肺部感染，并可經(jīng)淋巴或血液途徑播散至其它臟器經(jīng)皮膚或粘膜屏障破損處進(jìn)入人體－皮膚軟組織、眼睛、關(guān)節(jié)等，也可以引起血流感染8致病途徑真菌在自然界廣泛存在：吸入空氣中的真菌孢子可引起8微生物學(xué)證據(jù)深部真菌感染的診斷

需要考慮

宿主因素－免疫狀態(tài)臨床診斷確診相應(yīng)的臨床癥狀/體征/影像學(xué)

擬診

只

組織病理學(xué)證據(jù)和無(wú)菌

有

體液的鏡檢和培養(yǎng)陽(yáng)性定植

9微生物學(xué)證據(jù)深部真菌感染的診斷臨床診斷確相應(yīng)的臨床癥狀/910真菌體外病原學(xué)檢測(cè)方法

標(biāo)本的直接涂片

血或分泌物或病變組織培養(yǎng)

組織病理

血清學(xué)檢測(cè)

G，GM

隱球菌抗原，念珠菌抗原

曲霉菌IgG，念珠菌IgG

取血或分泌物做PCR10真菌體外病原學(xué)檢測(cè)方法標(biāo)本的直接涂片血或分泌物或1011臨床醫(yī)生懷疑－鑒別診斷

答案疑問(wèn)微生物標(biāo)本送檢敏感性？特異性？臨床意義？微生物結(jié)果解讀的困惑耗時(shí):?

鏡檢:

實(shí)時(shí)?

膠體金:

15分鐘?

GM：3小時(shí)?

培養(yǎng)：48小時(shí)11臨床醫(yī)生懷疑－鑒別診斷 答案微生物標(biāo)本送檢敏感性？微生物11涂片鏡檢（革蘭染色、KOH浮載劑鏡檢、HE染色、Giemsa染色、GMS染色、六胺銀染色）痰液、ETA、BALF、PSB采標(biāo)本、支氣管粘膜肺活檢標(biāo)本其他組織標(biāo)本黏蛋白卡紅染色鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌、六胺銀涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌具有確診價(jià)值。KOH浮載劑鏡檢可以發(fā)現(xiàn)絲狀真菌有重要臨床意義，是真菌病的強(qiáng)指征發(fā)現(xiàn)孢子/假菌絲通常指念珠菌，無(wú)臨床意義真菌培養(yǎng)痰、ETA、BALF、PSB標(biāo)本、胸腔積液、支氣管粘膜活檢標(biāo)本、肺活檢或其他組織標(biāo)本、血液，關(guān)節(jié)液，腦脊液等無(wú)菌體液采用無(wú)菌技術(shù)從通常無(wú)菌部位采集的標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)非無(wú)菌標(biāo)本應(yīng)注意除外定植或污染12真菌的形態(tài)學(xué)檢測(cè)涂片鏡檢痰液、ETA、BALF、黏蛋白卡紅染色鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌12呼吸道標(biāo)本相關(guān)檢測(cè)BAL：肺泡灌洗液；

#:

鏡檢陽(yáng)性是感染的強(qiáng)指證；$:

細(xì)菌平板培養(yǎng)的敏感性低于真菌平板培養(yǎng)；

*：PCR的敏感性高于培養(yǎng)

13檢測(cè)直接鏡檢找菌絲#

真菌培養(yǎng)（痰培養(yǎng)或肺泡灌洗液）$

組織標(biāo)本病理

真菌培養(yǎng)（經(jīng)胸吸引物）

曲霉PCR（氣道分泌物）*

細(xì)菌培養(yǎng)（痰液或肺泡灌洗液）推薦強(qiáng)度

A

A

A

B

C

C證據(jù)等級(jí)

II

III

II

II

II

IIt呼吸道標(biāo)本相關(guān)檢測(cè)BAL：肺泡灌洗液；#:鏡檢陽(yáng)性是感染1314真菌直接涂片KOH壓片×400痰等呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)孢子/假菌絲通常指念珠菌，無(wú)臨床意義14真菌直接涂片KOH壓片×400痰等呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)孢子/1415可見(jiàn)真菌孢子及假絲（念珠菌）可見(jiàn)真菌孢子未見(jiàn)假絲（念珠菌）無(wú)菌體液真菌直接涂片可以確診×1000×100015可見(jiàn)真菌孢子及假絲（念珠菌）可見(jiàn)真菌孢子未見(jiàn)假絲（念珠菌1516

找到真菌菌絲（絲狀真菌，如

曲霉、毛霉）有重要臨床意義

有隔菌絲，45°分枝：曲霉菌屬

無(wú)隔寬大菌絲：90°分枝毛霉菌目革蘭染色×1000×400棉蘭染色六胺銀染色KOH壓片16 找到真菌菌絲（絲狀真菌，如革蘭染色×1000×400棉1617直接涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可以確診墨汁染色革蘭染色×400×1000

×1000六胺銀染色17直接涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可以確診墨汁染色革蘭染色×400×1718肺泡灌洗液痰六胺銀染色發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌可確診×1000×100018肺泡灌洗液痰六胺銀染色發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌可確診×1000×11819

男，75歲，糖尿病

主訴：間斷發(fā)熱、咳嗽20天，加重伴氣短3天病例分享氣道吸出物培養(yǎng)：煙曲霉19男，75歲，糖尿病主訴：間斷發(fā)熱、咳嗽20天，加1920女，31歲，咳嗽伴活動(dòng)后氣短1月。腎病綜合征激素治療六胺銀染色：PCP20女，31歲，咳嗽伴活動(dòng)后氣短1月。腎病綜合征激素治療六胺2021

男，35歲，糖尿病，咳嗽伴發(fā)熱2月

WBC

7.52x109/L,

Neu

82%，LY12.5%BALF涂片：隱球菌BALF真菌培養(yǎng)：新型隱球菌21男，35歲，糖尿病，咳嗽伴發(fā)熱2月BALF涂片：隱球21

男，45歲，咳嗽、咳痰、喘憋伴高

熱，聲音嘶啞20余天。無(wú)基礎(chǔ)病，

農(nóng)民

接觸史：近期暴露霉變玉米

WBC

29.5×109/L，N%

91.4%亞胺培南治療無(wú)效

痰培養(yǎng)：煙曲霉（05-06、05-07、

05-09）

TBIL：肺泡結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡

腔可見(jiàn)少量吞噬細(xì)胞聚集。局部

可見(jiàn)壞死及炎癥性纖維素滲出，

周?chē)梢?jiàn)少量真菌及脫落的支氣

管上皮

免疫力正常宿主－吸入大量孢子

22男，45歲，咳嗽、咳痰、喘憋伴高亞胺培南治療無(wú)效2223尖端賽多孢子菌播散性感染

男，27歲，管路維修工

污水管路爆炸，吸入污水7分鐘，意識(shí)不清5小時(shí)就診

既往體健023尖端賽多孢子菌播散性感染02324

痰：奇異變形桿菌，MRSA，綠膿桿菌，頭地霉×2，光滑念株菌×3

關(guān)節(jié)液細(xì)菌和真菌培養(yǎng)：陰性

G試驗(yàn)

900pg/ml（<

20pg/ml）24痰：奇異變形桿菌，MRSA，綠膿桿菌，頭地霉×2，2425右膝關(guān)節(jié)穿刺：關(guān)節(jié)液血培養(yǎng)（5月3日）沙保羅培養(yǎng)基：白色棉花狀，菌落中心有黑心鏡下菌絲分隔，分生孢子卵圓型，著生于分子孢子梗頂端（尖端賽多孢子菌）

（棉酚藍(lán)染色×

400）25右膝關(guān)節(jié)穿刺：關(guān)節(jié)液血培養(yǎng)（5月3日）沙保羅培養(yǎng)基：白色25沙氏27℃沙氏35℃馬內(nèi)菲青霉

26血培養(yǎng)涂片×1000×1000病例：免疫缺陷－馬內(nèi)菲青霉女，23歲，廣西人?！伴g斷發(fā)熱20天，伴高熱、寒戰(zhàn)”沙氏27℃沙氏35℃馬內(nèi)菲青霉血培養(yǎng)涂片×1000×10002627

最簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法：1～2h可以報(bào)告結(jié)果

可為感染性疾病早期診治提供病原性依據(jù)

可提高慢生長(zhǎng)細(xì)菌的陽(yáng)性檢出率

合格標(biāo)本是提高直接鏡檢敏感性和特異性的關(guān)鍵

積極進(jìn)行無(wú)菌體液的真菌培養(yǎng)真菌直接鏡檢和培養(yǎng)小結(jié)27最簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法：1～2h可以報(bào)告結(jié)果2728侵襲性真菌感染的生物標(biāo)記物（免疫學(xué)方法）

泛真菌

1,3-β-D-葡聚糖（抗原G試驗(yàn)）

曲霉菌

半乳甘露聚糖（抗原GM）

抗體（IgG/IgM/IgE）

膠體金

念珠菌

甘露聚糖（抗原）

抗甘露聚糖抗體

念珠菌膠體金（Directigen

123）28侵襲性真菌感染的生物標(biāo)記物泛真菌1,3-β-D-28曲霉菌病念珠菌病敏感性特異性敏感性特異性引用文獻(xiàn)77%無(wú)記錄75無(wú)記錄Karageorgopoulos.CID2011;15;5:750-7076%85%8181Lu.InternalMed201177%83%8181Onishi.JCM2012;50:7-15291-3-β-D葡聚糖（G試驗(yàn)）

酵母菌和絲狀真菌細(xì)胞壁成分

泛真菌

肺孢子菌肺炎患者含量高Odabasi.

CID

2004;5;39:199-205.Pickering.

JCM

2005;43:5957-62.Ostrosky-Zeichner.

CID

2005;41:654-9.曲霉菌病念珠菌病敏感性特異性敏感性特異性引用文獻(xiàn)77%無(wú)記錄29患者敏感性,%(95%CI)特異性,%(95%CI)血液惡性腫瘤58(52–64)95(94–96)造血干細(xì)胞移植65(60–78)65(44–83)實(shí)體器官移植41(21–64)85(80–89)半乳甘露聚糖（GM）

半乳甘露聚糖

（GM）

試驗(yàn)已經(jīng)過(guò)一些Meta

分析的評(píng)估1–2，用不同

的cut-off值來(lái)確定陽(yáng)性

相較于接受實(shí)體器官移

植的患者，GM試驗(yàn)更

適用于接受重度化療的

患者1.

Mennink-Kersten

MA,

et

al.

LancetInfect

Dis

2004;4:349–572.

Leeflang

MM,

et

al.

CochraneDatabase

Syst

Rev

2008;8:CD007394

不同基礎(chǔ)疾病下敏感性不同

診斷驅(qū)動(dòng)治療策略：每3-4天進(jìn)行GM監(jiān)測(cè)，并結(jié)合臨床和微生物學(xué)評(píng)

價(jià)，以及高分辨率CT影像學(xué)

（AII

建議）

30患者敏感性,%特異性,%血液惡性腫瘤58(52–64)95(3031肺泡灌洗液GM試驗(yàn)－侵襲性肺曲霉菌感染敏感性

90

90特異性

94

96.4

引用文獻(xiàn)

Guo,

Chest

2010Avni,

JCM

2011;4:665-7087929498Zou,

PlosOne

2012;

7:e52833

Heng,

Crit

Rev

Microbiol

2015;41:124-34

(haematological

patients)Cut-off：

0.531肺泡灌洗液GM試驗(yàn)－侵襲性肺曲霉菌感染敏感性特異性 引31

GM對(duì)慢性肺曲霉病診斷的貢獻(xiàn)

肺泡灌洗液GM抗原檢測(cè)在取0.7為折點(diǎn)時(shí)，對(duì)慢性肺曲霉病診斷的敏感性

和陽(yáng)性率是66.7%和63.5%。當(dāng)取折點(diǎn)為0.4的時(shí)候，肺泡灌洗液GM檢測(cè)

的敏感率和特異性約為77.2%和77.0%

在另一個(gè)研究中，在折點(diǎn)＞0.5時(shí)肺泡灌洗液的GM抗原檢測(cè)敏感性和特

異性為85.7%和76.3%

近期的一個(gè)研究血清GM的敏感性僅為23%。因此BAL（SoR

B,

QoE

II）

GM應(yīng)該被用于慢性肺曲霉病的診斷而非血清（SoR

C

and

QoE

III）GMSoR：推薦強(qiáng)度；QoE：循證等級(jí)；BAL：肺泡灌洗液

32人群空腔或結(jié)節(jié)非免疫抑制患者肺部滲出

目的診斷和排除慢性肺曲霉病

備注抗原檢測(cè)涉及灌洗液和血清，但不包含痰液

措施BAL

抗原血清

抗原SoR

B

CQoE

II

II

Ref.

[38][28，38，39]痰液

抗原無(wú)數(shù)據(jù) GM對(duì)慢性肺曲霉病診斷的貢獻(xiàn)SoR：推薦強(qiáng)度；QoE：循證3233曲霉抗體檢測(cè)

曲霉特異性抗體檢測(cè)是慢性肺曲霉病的一個(gè)關(guān)鍵診斷。感染患

者和定植患者可以通過(guò)曲霉特異性抗體的不同表現(xiàn)加以區(qū)分，

診斷感染的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）為100%

所有患者懷疑慢性或亞急性侵襲性曲霉病均應(yīng)進(jìn)行曲霉特異性抗體IgG或曲霉沉淀素檢測(cè)

煙曲霉特異性抗體IgE檢測(cè)（尤其是在哮喘囊性纖維化患者中和ABPA）2015年慢性肺曲霉?。涸\斷和疾病管理理論說(shuō)明以及臨床指南33曲霉抗體檢測(cè)曲霉特異性抗體檢測(cè)是慢性肺曲霉病的一個(gè)關(guān)33iACPAABPAGM62%22％0%IgG65%100%65%IgE0%66%100%34曲霉菌抗體檢測(cè)?

IA：侵襲性曲霉病?

CPA：慢性肺曲霉病?

ABPA：過(guò)敏性支氣管肺曲霉病?

基于6.3萬(wàn)IA，24萬(wàn)

CPA和88.7萬(wàn)ABPAPage.

Medical

Mycology

2015曲霉抗原曲霉特異性IgG曲霉特異性IgE抗體檢測(cè)診斷曲霉病——現(xiàn)狀與展望iACPAABPAGM62%22％0%IgG65%100%6343552歲，2007年肺結(jié)核咳嗽咳痰

2年，口服伊曲康唑一年好轉(zhuǎn)，再次加重半年，抗結(jié)核治療無(wú)效曲霉菌IgG

106Au/ml肺結(jié)核繼發(fā)慢性肺曲霉菌病病例分享3552歲，2007年肺結(jié)核咳嗽咳痰2年，口服伊曲康唑一年3536女，45歲2009年，因虹膜炎糖皮質(zhì)激素治療好轉(zhuǎn)2011年，因干咳就診，發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)陰影，胸腔鏡肺活檢病理診斷結(jié)節(jié)病，拒絕激素治療，每年隨訪2016年10月份開(kāi)始咳嗽明顯加重，干咳為主，無(wú)發(fā)熱，盜汗，伏立康唑治療10天，后出現(xiàn)咯血，考慮肺結(jié)核，患者就診結(jié)研所結(jié)節(jié)病合并慢性肺曲霉菌病36女，45歲2009年，因虹膜炎糖皮質(zhì)激素治療好轉(zhuǎn)2011362016年11月-12月在結(jié)研所住院，痰及支氣管鏡BALF抗酸涂片，分枝桿菌培養(yǎng)和Gene—Xpert均陰性。頸部淋巴結(jié)活檢提示上皮樣肉芽腫改變，未見(jiàn)壞死，首先考慮結(jié)節(jié)病。考慮影像學(xué)仍不能除外肺結(jié)核，抗結(jié)核治療（HRZE，后HRELfx）治療4周無(wú)效，咳嗽，氣短加重SACE

37.6IU

嗜酸達(dá)16%

372016.112014.42016年11月-12月在結(jié)研所住院，痰及支氣管鏡BALF抗3738曲霉IgE

1.58KIU/L（2級(jí)）總IgE

1127KIU/L曲霉IgG＞500Au/ml

血GM0.13伏立康唑

200mg

Bid

2個(gè)月強(qiáng)的松

30mg/d38曲霉IgE1.58KIU/L（2級(jí)）總IgE11273839其它用于鑒別真菌病的血清學(xué)方法

侵襲性念珠菌?。焊事毒厶强乖?甘露聚糖抗體聯(lián)合檢測(cè)法

抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)敏感性和特異性為83%和86%

隱球菌：莢膜抗原檢測(cè)（乳膠凝集，膠體金）

G試驗(yàn)檢測(cè)范圍：個(gè)例報(bào)道組織胞漿菌、尖端賽多孢、鏈格孢、枝頂孢，鐮刀菌39其它用于鑒別真菌病的血清學(xué)方法侵襲性念珠菌病：甘露聚3940

簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法

G，GM結(jié)果解讀需要密切結(jié)合臨床，建議高危人群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

BALF的GM測(cè)定敏感性和特異性比血清GM高

曲霉菌抗體IgG用于診斷慢性肺曲霉菌感染

曲霉菌抗體IgE用于診斷變應(yīng)性支氣管肺曲霉菌病血清學(xué)方法小結(jié)40簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法G，GM結(jié)果解40實(shí)驗(yàn)室結(jié)果慢性肺曲霉病煙曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性率7/42（16.7%）曲霉菌屬qPCR檢測(cè)陽(yáng)性率30/42（71.4%）41Denning

et

al.

Clin

Infect

Dis

2011;52:1123痰標(biāo)本中曲霉菌的分子檢查敏感性高于培養(yǎng)。感染和高真菌負(fù)荷的患者通常信號(hào)強(qiáng)度是強(qiáng)的在抗真菌治療過(guò)程中檢測(cè)出強(qiáng)PCR信號(hào)多數(shù)與抗真菌耐藥相關(guān)。同時(shí)在技術(shù)層面上能夠直接診斷關(guān)鍵的耐藥突變分子診斷方法（PCR）實(shí)驗(yàn)室結(jié)果慢性肺曲霉病煙曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性率7/42（16.7%）4142分子檢測(cè)局限性

污染！

采血管

運(yùn)儲(chǔ)時(shí)間：人DNA酶和RNA酶可能降解病原體游離DNA

幾乎所有的商業(yè)化檢測(cè)

僅供科學(xué)研究

僅限研究目的

缺乏驗(yàn)證

不可作為單一檢測(cè)使用

檢測(cè)結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎考慮

“分子檢測(cè)方法不能完全替代培養(yǎng)、鏡檢及臨床檢查（病史、體征和癥狀），但它是很有價(jià)值的補(bǔ)充診斷方法”42分子檢測(cè)局限性污染！運(yùn)儲(chǔ)時(shí)間：人DNA酶和R4243總結(jié)

真菌診斷仍面臨挑戰(zhàn)

病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷非常重要

重視直接鏡檢

真菌培養(yǎng)

結(jié)合抗原抗體

臨床＋影像＋微生物證據(jù)43總結(jié)真菌診斷仍面臨挑戰(zhàn)病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷4344謝謝！44謝謝！441深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷北京朝陽(yáng)醫(yī)院

谷麗1深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷北京朝陽(yáng)醫(yī)院谷麗452教師簡(jiǎn)介

畢業(yè)于北京協(xié)和醫(yī)院，獲呼吸內(nèi)科醫(yī)學(xué)

博士學(xué)位。2012-2013年于美國(guó)西北大

學(xué)醫(yī)學(xué)院做訪問(wèn)學(xué)者一年

首都醫(yī)科大學(xué)朝陽(yáng)醫(yī)院感染和臨床微生

物科副主任

中華醫(yī)學(xué)會(huì)北京感染分會(huì)委員

從事感染性疾病臨床和科研工作，包括

呼吸道感染、復(fù)雜泌尿系感染、中樞神

經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、皮膚軟組織感

染、免疫缺陷（器官移植術(shù)后、激素和

免疫抑制劑應(yīng)用后）繼發(fā)感染，以及復(fù)

雜性不明原因發(fā)熱等

貼照片處（照片尺寸9.4×6.8cm）

谷麗

主任醫(yī)師2教師簡(jiǎn)介畢業(yè)于北京協(xié)和醫(yī)院，獲呼吸內(nèi)科醫(yī)學(xué) 貼照片處463導(dǎo)讀疾病常伴有真菌感染，病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷非常重要，而真菌診斷仍面臨挑戰(zhàn)。臨床常用的診斷方法有直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、結(jié)合抗原抗體。臨床醫(yī)生需要結(jié)合臨床＋影像＋微生物證據(jù)來(lái)確診并給予合適的治療3導(dǎo)讀疾病常伴有真菌感染，病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷非常重要，而474學(xué)習(xí)目標(biāo)深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法掌握每種診斷方法的臨床應(yīng)用4學(xué)習(xí)目標(biāo)深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法485內(nèi)容概況真菌感染基本概念

致病性分類(lèi)

形態(tài)分類(lèi)

致病途徑實(shí)驗(yàn)室診斷方法及臨床應(yīng)用

直接鏡檢

真菌培養(yǎng)

抗原抗體檢測(cè)

分子診斷（PCR）臨床病例分享5內(nèi)容概況真菌感染基本概念致病性分類(lèi)實(shí)驗(yàn)室診斷方法及496按照真菌致病性的分類(lèi)

原發(fā)致病性真菌

致病性真菌本身具有很強(qiáng)的致病性，可使免疫正

常宿主致病如：組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西

副球孢子菌、皮炎芽生菌著色真菌、足分支菌、

孢子絲菌等

多呈地區(qū)性流行－南北美洲

條件致病性真菌－占主要地位，呈上升趨勢(shì)

正常情況下不致病，在特定條件能引起疾病，通

常是在機(jī)體的局部或全身免疫功能降低病菌寄居

部位的改變6按照真菌致病性的分類(lèi)原發(fā)致病性真菌致病性真菌本身具507按照真菌生長(zhǎng)的形態(tài)分類(lèi)

霉菌（molds）：多細(xì)胞真菌，包含分支的管狀結(jié)構(gòu)——菌

絲環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，形成菌絲體，如曲菌、毛霉菌。繁殖方式：

孢子形成

酵母菌（yeasts）：?jiǎn)渭?xì)胞真菌，呈圓形或卵圓形，如新型

隱球菌以出芽方式進(jìn)行繁殖。有些可以形成假菌絲（如白色

念珠菌）

雙相真菌（dimorphicfungi）：可以酵母菌和霉菌兩種形式

存在。環(huán)境中以霉菌形式生長(zhǎng)，孢子入侵人體后，以酵母菌

樣形式生長(zhǎng)。如組織胞漿菌

、馬尼菲青霉菌

37

°C

–酵母相

27

°C

–菌絲相煙曲霉菌酵母菌7按照真菌生長(zhǎng)的形態(tài)分類(lèi)煙曲霉菌酵母菌518致病途徑真菌在自然界廣泛存在：吸入空氣中的真菌孢子可引起支氣管肺部感染，并可經(jīng)淋巴或血液途徑播散至其它臟器經(jīng)皮膚或粘膜屏障破損處進(jìn)入人體－皮膚軟組織、眼睛、關(guān)節(jié)等，也可以引起血流感染8致病途徑真菌在自然界廣泛存在：吸入空氣中的真菌孢子可引起52微生物學(xué)證據(jù)深部真菌感染的診斷

需要考慮

宿主因素－免疫狀態(tài)臨床診斷確診相應(yīng)的臨床癥狀/體征/影像學(xué)

擬診

只

組織病理學(xué)證據(jù)和無(wú)菌

有

體液的鏡檢和培養(yǎng)陽(yáng)性定植

9微生物學(xué)證據(jù)深部真菌感染的診斷臨床診斷確相應(yīng)的臨床癥狀/5310真菌體外病原學(xué)檢測(cè)方法

標(biāo)本的直接涂片

血或分泌物或病變組織培養(yǎng)

組織病理

血清學(xué)檢測(cè)

G，GM

隱球菌抗原，念珠菌抗原

曲霉菌IgG，念珠菌IgG

取血或分泌物做PCR10真菌體外病原學(xué)檢測(cè)方法標(biāo)本的直接涂片血或分泌物或5411臨床醫(yī)生懷疑－鑒別診斷

答案疑問(wèn)微生物標(biāo)本送檢敏感性？特異性？臨床意義？微生物結(jié)果解讀的困惑耗時(shí):?

鏡檢:

實(shí)時(shí)?

膠體金:

15分鐘?

GM：3小時(shí)?

培養(yǎng)：48小時(shí)11臨床醫(yī)生懷疑－鑒別診斷 答案微生物標(biāo)本送檢敏感性？微生物55涂片鏡檢（革蘭染色、KOH浮載劑鏡檢、HE染色、Giemsa染色、GMS染色、六胺銀染色）痰液、ETA、BALF、PSB采標(biāo)本、支氣管粘膜肺活檢標(biāo)本其他組織標(biāo)本黏蛋白卡紅染色鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌、六胺銀涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌具有確診價(jià)值。KOH浮載劑鏡檢可以發(fā)現(xiàn)絲狀真菌有重要臨床意義，是真菌病的強(qiáng)指征發(fā)現(xiàn)孢子/假菌絲通常指念珠菌，無(wú)臨床意義真菌培養(yǎng)痰、ETA、BALF、PSB標(biāo)本、胸腔積液、支氣管粘膜活檢標(biāo)本、肺活檢或其他組織標(biāo)本、血液，關(guān)節(jié)液，腦脊液等無(wú)菌體液采用無(wú)菌技術(shù)從通常無(wú)菌部位采集的標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)非無(wú)菌標(biāo)本應(yīng)注意除外定植或污染12真菌的形態(tài)學(xué)檢測(cè)涂片鏡檢痰液、ETA、BALF、黏蛋白卡紅染色鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌56呼吸道標(biāo)本相關(guān)檢測(cè)BAL：肺泡灌洗液；

#:

鏡檢陽(yáng)性是感染的強(qiáng)指證；$:

細(xì)菌平板培養(yǎng)的敏感性低于真菌平板培養(yǎng)；

*：PCR的敏感性高于培養(yǎng)

13檢測(cè)直接鏡檢找菌絲#

真菌培養(yǎng)（痰培養(yǎng)或肺泡灌洗液）$

組織標(biāo)本病理

真菌培養(yǎng)（經(jīng)胸吸引物）

曲霉PCR（氣道分泌物）*

細(xì)菌培養(yǎng)（痰液或肺泡灌洗液）推薦強(qiáng)度

A

A

A

B

C

C證據(jù)等級(jí)

II

III

II

II

II

IIt呼吸道標(biāo)本相關(guān)檢測(cè)BAL：肺泡灌洗液；#:鏡檢陽(yáng)性是感染5714真菌直接涂片KOH壓片×400痰等呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)孢子/假菌絲通常指念珠菌，無(wú)臨床意義14真菌直接涂片KOH壓片×400痰等呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)孢子/5815可見(jiàn)真菌孢子及假絲（念珠菌）可見(jiàn)真菌孢子未見(jiàn)假絲（念珠菌）無(wú)菌體液真菌直接涂片可以確診×1000×100015可見(jiàn)真菌孢子及假絲（念珠菌）可見(jiàn)真菌孢子未見(jiàn)假絲（念珠菌5916

找到真菌菌絲（絲狀真菌，如

曲霉、毛霉）有重要臨床意義

有隔菌絲，45°分枝：曲霉菌屬

無(wú)隔寬大菌絲：90°分枝毛霉菌目革蘭染色×1000×400棉蘭染色六胺銀染色KOH壓片16 找到真菌菌絲（絲狀真菌，如革蘭染色×1000×400棉6017直接涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可以確診墨汁染色革蘭染色×400×1000

×1000六胺銀染色17直接涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可以確診墨汁染色革蘭染色×400×6118肺泡灌洗液痰六胺銀染色發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌可確診×1000×100018肺泡灌洗液痰六胺銀染色發(fā)現(xiàn)人肺孢子菌可確診×1000×16219

男，75歲，糖尿病

主訴：間斷發(fā)熱、咳嗽20天，加重伴氣短3天病例分享氣道吸出物培養(yǎng)：煙曲霉19男，75歲，糖尿病主訴：間斷發(fā)熱、咳嗽20天，加6320女，31歲，咳嗽伴活動(dòng)后氣短1月。腎病綜合征激素治療六胺銀染色：PCP20女，31歲，咳嗽伴活動(dòng)后氣短1月。腎病綜合征激素治療六胺6421

男，35歲，糖尿病，咳嗽伴發(fā)熱2月

WBC

7.52x109/L,

Neu

82%，LY12.5%BALF涂片：隱球菌BALF真菌培養(yǎng)：新型隱球菌21男，35歲，糖尿病，咳嗽伴發(fā)熱2月BALF涂片：隱球65

男，45歲，咳嗽、咳痰、喘憋伴高

熱，聲音嘶啞20余天。無(wú)基礎(chǔ)病，

農(nóng)民

接觸史：近期暴露霉變玉米

WBC

29.5×109/L，N%

91.4%亞胺培南治療無(wú)效

痰培養(yǎng)：煙曲霉（05-06、05-07、

05-09）

TBIL：肺泡結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡

腔可見(jiàn)少量吞噬細(xì)胞聚集。局部

可見(jiàn)壞死及炎癥性纖維素滲出，

周?chē)梢?jiàn)少量真菌及脫落的支氣

管上皮

免疫力正常宿主－吸入大量孢子

22男，45歲，咳嗽、咳痰、喘憋伴高亞胺培南治療無(wú)效6623尖端賽多孢子菌播散性感染

男，27歲，管路維修工

污水管路爆炸，吸入污水7分鐘，意識(shí)不清5小時(shí)就診

既往體健023尖端賽多孢子菌播散性感染06724

痰：奇異變形桿菌，MRSA，綠膿桿菌，頭地霉×2，光滑念株菌×3

關(guān)節(jié)液細(xì)菌和真菌培養(yǎng)：陰性

G試驗(yàn)

900pg/ml（<

20pg/ml）24痰：奇異變形桿菌，MRSA，綠膿桿菌，頭地霉×2，6825右膝關(guān)節(jié)穿刺：關(guān)節(jié)液血培養(yǎng)（5月3日）沙保羅培養(yǎng)基：白色棉花狀，菌落中心有黑心鏡下菌絲分隔，分生孢子卵圓型，著生于分子孢子梗頂端（尖端賽多孢子菌）

（棉酚藍(lán)染色×

400）25右膝關(guān)節(jié)穿刺：關(guān)節(jié)液血培養(yǎng)（5月3日）沙保羅培養(yǎng)基：白色69沙氏27℃沙氏35℃馬內(nèi)菲青霉

26血培養(yǎng)涂片×1000×1000病例：免疫缺陷－馬內(nèi)菲青霉女，23歲，廣西人?！伴g斷發(fā)熱20天，伴高熱、寒戰(zhàn)”沙氏27℃沙氏35℃馬內(nèi)菲青霉血培養(yǎng)涂片×1000×10007027

最簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法：1～2h可以報(bào)告結(jié)果

可為感染性疾病早期診治提供病原性依據(jù)

可提高慢生長(zhǎng)細(xì)菌的陽(yáng)性檢出率

合格標(biāo)本是提高直接鏡檢敏感性和特異性的關(guān)鍵

積極進(jìn)行無(wú)菌體液的真菌培養(yǎng)真菌直接鏡檢和培養(yǎng)小結(jié)27最簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的診斷方法：1～2h可以報(bào)告結(jié)果7128侵襲性真菌感染的生物標(biāo)記物（免疫學(xué)方法）

泛真菌

1,3-β-D-葡聚糖（抗原G試驗(yàn)）

曲霉菌

半乳甘露聚糖（抗原GM）

抗體（IgG/IgM/IgE）

膠體金

念珠菌

甘露聚糖（抗原）

抗甘露聚糖抗體

念珠菌膠體金（Directigen

123）28侵襲性真菌感染的生物標(biāo)記物泛真菌1,3-β-D-72曲霉菌病念珠菌病敏感性特異性敏感性特異性引用文獻(xiàn)77%無(wú)記錄75無(wú)記錄Karageorgopoulos.CID2011;15;5:750-7076%85%8181Lu.InternalMed201177%83%8181Onishi.JCM2012;50:7-15291-3-β-D葡聚糖（G試驗(yàn)）

酵母菌和絲狀真菌細(xì)胞壁成分

泛真菌

肺孢子菌肺炎患者含量高Odabasi.

CID

2004;5;39:199-205.Pickering.

JCM

2005;43:5957-62.Ostrosky-Zeichner.

CID

2005;41:654-9.曲霉菌病念珠菌病敏感性特異性敏感性特異性引用文獻(xiàn)77%無(wú)記錄73患者敏感性,%(95%CI)特異性,%(95%CI)血液惡性腫瘤58(52–64)95(94–96)造血干細(xì)胞移植65(60–78)65(44–83)實(shí)體器官移植41(21–64)85(80–89)半乳甘露聚糖（GM）

半乳甘露聚糖

（GM）

試驗(yàn)已經(jīng)過(guò)一些Meta

分析的評(píng)估1–2，用不同

的cut-off值來(lái)確定陽(yáng)性

相較于接受實(shí)體器官移

植的患者，GM試驗(yàn)更

適用于接受重度化療的

患者1.

Mennink-Kersten

MA,

et

al.

LancetInfect

Dis

2004;4:349–572.

Leeflang

MM,

et

al.

CochraneDatabase

Syst

Rev

2008;8:CD007394

不同基礎(chǔ)疾病下敏感性不同

診斷驅(qū)動(dòng)治療策略：每3-4天進(jìn)行GM監(jiān)測(cè)，并結(jié)合臨床和微生物學(xué)評(píng)

價(jià)，以及高分辨率CT影像學(xué)

（AII

建議）

30患者敏感性,%特異性,%血液惡性腫瘤58(52–64)95(7431肺泡灌洗液GM試驗(yàn)－侵襲性肺曲霉菌感染敏感性

90

90特異性

94

96.4

引用文獻(xiàn)

Guo,

Chest

2010Avni,

JCM

2011;4:665-7087929498Zou,

PlosOne

2012;

7:e52833

Heng,

Crit

Rev

Microbiol

2015;41:124-34

(haematological

patients)Cut-off：

0.531肺泡灌洗液GM試驗(yàn)－侵襲性肺曲霉菌感染敏感性特異性 引75

GM對(duì)慢性肺曲霉病診斷的貢獻(xiàn)

肺泡灌洗液GM抗原檢測(cè)在取0.7為折點(diǎn)時(shí)，對(duì)慢性肺曲霉病診斷的敏感性

和陽(yáng)性率是66.7%和63.5%。當(dāng)取折點(diǎn)為0.4的時(shí)候，肺泡灌洗液GM檢測(cè)

的敏感率和特異性約為77.2%和77.0%

在另一個(gè)研究中，在折點(diǎn)＞0.5時(shí)肺泡灌洗液的GM抗原檢測(cè)敏感性和特

異性為85.7%和76.3%

近期的一個(gè)研究血清GM的敏感性僅為23%。因此BAL（SoR

B,

QoE

II）

GM應(yīng)該被用于慢性肺曲霉病的診斷而非血清（SoR

C

and

QoE

III）GMSoR：推薦強(qiáng)度；QoE：循證等級(jí)；BAL：肺泡灌洗液

32人群空腔或結(jié)節(jié)非免疫抑制患者肺部滲出

目的診斷和排除慢性肺曲霉病

備注抗原檢測(cè)涉及灌洗液和血清，但不包含痰液

措施BAL

抗原血清

抗原SoR

B

CQoE

II

II

Ref.

[38][28，38，39]痰液

抗原無(wú)數(shù)據(jù) GM對(duì)慢性肺曲霉病診斷的貢獻(xiàn)SoR：推薦強(qiáng)度；QoE：循證7633曲霉抗體檢測(cè)

曲霉特異性抗體檢測(cè)是慢性肺曲霉病的一個(gè)關(guān)鍵診斷。感染患

者和定植患者可以通過(guò)曲霉特異性抗體的不同表現(xiàn)加以區(qū)分，

診斷感染的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）為100%

所有患者懷疑慢性或亞急性侵襲性曲霉病均應(yīng)進(jìn)行曲霉特異性抗體IgG或曲霉沉淀素檢測(cè)

煙曲霉特異性抗體IgE檢測(cè)（尤其是在哮喘囊性纖維化患者中和ABPA）2015年慢性肺曲霉?。涸\斷和疾病管理理論說(shuō)明以及臨床指南33曲霉抗體檢測(cè)曲霉特異性抗體檢測(cè)是慢性肺曲霉病的一個(gè)關(guān)77iACPAABPAGM62%22％0%IgG65%100%65%IgE0%66%100%34曲霉菌抗體檢測(cè)?

IA：侵襲性曲霉病?

CPA：慢性肺曲霉病?

ABPA：過(guò)敏性支氣管肺曲霉病?

基于6.3萬(wàn)IA，24萬(wàn)

CPA和88.7萬(wàn)ABPAPage.

Medical

Mycology

2015曲霉抗原曲霉特異性IgG曲霉特異性IgE抗體檢測(cè)診斷曲霉病——現(xiàn)狀與展望iACPAAB