L-脯氨酸的生產(chǎn)工藝

生工08級(jí)3班制片人：朱春旭楊一川張興建

脯氨酸

脯氨酸(Proline,C5H9NO2),為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,有苦味和獨(dú)特的甜味,易溶于水和乙醇,不溶于乙醚和異丙醇。其天然品存在于明膠、干酪索、面筋等,在膠原蛋白中的含量較多。脯氨酸是復(fù)方氨基酸大輸液的原料之一,主要用于營(yíng)養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)缺乏癥、嚴(yán)重腸胃疾患、燙傷及外科手術(shù)后的蛋白質(zhì)補(bǔ)充;也能改善果汁飲料、清涼飲料及多種食品的風(fēng)味。工業(yè)制造L-脯氨酸，最早用動(dòng)物膠水解提取的。1965年前后，吉永、大和谷、千畑、野口等相繼報(bào)道了L-脯氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。發(fā)酵法主要采用谷氨酸產(chǎn)生菌的突變株，近來(lái)已引入基因工程技術(shù)，用非谷氨酸產(chǎn)生菌由糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-脯氨酸。脯氨酸從天然蛋白質(zhì)中提取L-脯氨酸的生產(chǎn)途徑：

如寧波生物激素廠，從明膠中提取，生產(chǎn)少量生化試劑；上海達(dá)康氨基酸廠從明膠或毛發(fā)水解液中提取L-脯氨酸，但明膠原料貴；又如上海東海制藥廠，天津塘沽水產(chǎn)加工廠曾從魚(yú)皮中提取，進(jìn)行小批量生產(chǎn)；上海有機(jī)化學(xué)研究所與上海南匯恒美日用化工廠協(xié)作，從雞毛中分離L-脯氨酸等。發(fā)酵法生產(chǎn)L-脯氨酸在微生物中，L-脯氨酸的合成是由葡萄糖生成谷氨酸，在由谷氨酸經(jīng)過(guò)四步反應(yīng)而生成的。其合成的途徑如下：葡萄糖→谷氨酸→γ-谷氨酰磷酸→L-谷氨酸-γ-半醛→Δ＇砒哆啉-5-羧酸（自發(fā)合成）→L-脯氨酸

我們以黃色短桿菌No.14-5（異亮氨酸缺陷）為例子對(duì)L-脯氨酸發(fā)酵進(jìn)行研究。黃色短桿菌按上述途徑合成L-脯氨酸，幾乎沒(méi)有鳥(niǎo)氨酸合成的乙酰化途徑，也就是說(shuō)幾乎沒(méi)有鳥(niǎo)氨酸-酮酸轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)1967年，吉永等指出ATP和能夠促進(jìn)黃色短桿菌No.14-5由L-谷氨酸生成L-脯氨酸，而且谷氨酸的磷酸化反應(yīng)參與了脯氨酸的生物合成。

草酰乙酸→天冬氨酸↓天冬氨酰磷酸↓天冬氨酸-β-半醛↙↘高絲氨酸二氫吡啶-2,6-二羧酸↙↘↓高絲氨酸磷酸O-琥珀酰高絲氨酸↓↓↓↓↓↓↓L-蘇氨酸↓↓↓↓↓↓L-蛋氨酸L-賴(lài)氨酸↓L-異亮氨酸

L-蘇氨酸脫水酶的缺失天冬氨酸激酶

與賴(lài)氨酸協(xié)同反饋抑制高絲氨酸激酶抑制使草酰乙酸消耗減少上述有2項(xiàng)ATP有剩余，使以ATP為輔酶的谷氨酸激酶反應(yīng)更容易，從而導(dǎo)致谷氨酸向脯氨酸轉(zhuǎn)變。黃色短桿菌No.14-5（異亮氨酸缺陷）產(chǎn)生脯氨酸的重要原因是：產(chǎn)生菌通過(guò)把難以通過(guò)的谷氨酸轉(zhuǎn)換為容易透過(guò)的脯氨酸的方式，完成了菌體內(nèi)大量谷氨酸的解毒，所以L-脯氨酸大量積累。思考：1.在黃色短桿菌No.14-5的L-脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，細(xì)胞膜的通透性的程度？既然谷氨酸是生成L-脯氨酸的前體物質(zhì)，那么對(duì)谷氨酸的生成的控制至關(guān)重要。

用L-谷氨酸產(chǎn)生菌突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-脯氨酸，培養(yǎng)基都是在L-谷氨酸發(fā)酵的基本培養(yǎng)基中，添加高濃度的，充分生長(zhǎng)所需要的生物素及所需要氨基酸或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（按限制生長(zhǎng)的濃度）。方佩靜等在選育產(chǎn)L-脯氨酸的變異株中，由北京棒桿菌AS1.299誘變獲得一株鳥(niǎo)氨酸缺陷變異株AS1.727。在適宜條件下，該突變株可產(chǎn)L-脯氨酸25~27g/L.郭慧珍等以谷氨酸棒狀桿菌NO.94為出發(fā)菌，經(jīng)誘變后獲得磺胺胍和DL-3，4-脫氫脯氨酸雙重抗性變異株。該菌株產(chǎn)酸率隨著生物素的增加而增加，當(dāng)生物素濃度達(dá)到300ug/L時(shí)，產(chǎn)酸最高。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖18%，氯化氨6%，生物素300ug/L。該菌在5000L發(fā)酵罐中連續(xù)發(fā)酵6罐，產(chǎn)L-脯氨酸30~33g/L，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為20%，提取收的率為44.4%。中西透等以嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870為出發(fā)菌，