基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)無需抗體富集直接檢測血清M蛋白方法的建立多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)第二大惡性腫瘤，以單克隆漿細(xì)胞在骨髓中惡性增殖并分泌大量異常單克隆免疫球蛋白及其片段（monoclonalprotein，M蛋白）為特點［1,

2］。血清中出現(xiàn)M蛋白是多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）的突出特點，且M蛋白濃度與臨床癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，故可作為MM的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物［3］。早期鑒定M蛋白，進(jìn)行及時有效干預(yù)，并追蹤疾病進(jìn)程和治療反應(yīng)，是降低MM發(fā)病率和死亡率的重要手段［4］。血清蛋白電泳（serumproteinelectrophoresis，SPE）和免疫固定電泳法（immunefixationelectrophoresis，IFE）是多發(fā)性骨髓瘤的一線檢測方法［5,

6］，其在疾病診斷、監(jiān)測和療效評估方面發(fā)揮了重要作用。每個M蛋白都來自克隆B細(xì)胞的重鏈和輕鏈位點的重組和體細(xì)胞過度突變產(chǎn)生。因此，M-蛋白既具有獨特的氨基酸序列，又具有獨特的分子量。常規(guī)的M蛋白檢測方法如電泳法，無法依靠這些獨特的M蛋白特征區(qū)分，主要是根據(jù)電泳遷移的區(qū)域進(jìn)行判定，而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）是基于蛋白質(zhì)獨特的分子量進(jìn)行檢測，且具有高通量、檢測速度快及無攜帶污染等特點，非常適合作為M蛋白的理想測定方法［7,

8,

9］。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展及在臨床檢驗中的廣泛應(yīng)用，采用質(zhì)譜技術(shù)檢測M蛋白成為研究熱點，應(yīng)用MALDI-TOFMS技術(shù)進(jìn)行M蛋白的測定已越來越受到人們的關(guān)注［10,

11,

12］。為降低檢測成本，簡化檢測流程，本研究擬建立一種無需抗體富集直接檢測血清M蛋白的MALDI-TOFMS測定方法，用于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和監(jiān)測，并結(jié)合經(jīng)過化療等相關(guān)治療的病例，初步探討該法在疾病療效評估中的臨床價值。材料與方法一、材料1.血清標(biāo)本：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院申請M蛋白鑒定檢測的患者檢驗后剩余血清標(biāo)本712份。這712份標(biāo)本中M蛋白電泳陽性標(biāo)本367份（其中100份僅為IFE陽性）和電泳陰性標(biāo)本345份。M蛋白陽性標(biāo)本中IgG209份、IgA81份、IgD13份、IgM12份、輕鏈λ型25份、輕鏈κ型16份，雙克隆型11份。本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理第2021-科-263-1）。2.試劑：三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽［Tris-（2-carboxyethyl）-phosphinehydrochloride，TCEP］、Tris緩沖液、三氟乙酸、HPLC級乙腈、HPLC級4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸和IgA、IgG純品購自美國Sigma-Aldrich公司，OptiliteFreeliteKappa/Lambda游離輕鏈檢測試劑盒購自英國BindingSite公司，免疫球蛋白全組分抗血清試劑盒購自法國Sebia公司。3.儀器：本研究使用的主要分析系統(tǒng)包括QuanTOF寬譜定量飛行時間質(zhì)譜儀（青島融智生物）和Optilite特種蛋白分析儀（英國BindingSite公司）以及SebiaHYDRASYS全自動電泳儀（法國Sebia公司）和BeckmanIMMAGE800特種蛋白分析儀（美國Beckman公司）。二、檢測方法1.M蛋白的選擇與鑒定：本研究對單克隆免疫球蛋白進(jìn)行還原水解，將總的單克隆輕鏈作為最佳的M蛋白標(biāo)志物。使用IgA純品對標(biāo)本中的κ和λ輕鏈進(jìn)行鑒定和識別，確定待測物的相對分子質(zhì)量范圍。2.標(biāo)本前處理：（1）稀釋：血清標(biāo)本80倍稀釋；（2）還原：0.4mol/LTCEP溶液還原20min，標(biāo)本稀釋液與還原劑體積比為4∶1；（3）基質(zhì)液復(fù)溶：10g/L的4-乙氧基-3-甲氧基肉桂酸溶液（50%乙腈+50%0.1%TFA水溶液）5倍復(fù)溶。3.MALDI-TOFMS分析：（1）將上述2.5μl基質(zhì)復(fù)溶液點于96孔靶板，每個標(biāo)本點樣時重復(fù)2次，靶板加熱至結(jié)晶。（2）將點樣好的靶板放入MALDI-TOFMS質(zhì)譜儀，進(jìn)行靶板位置校正，設(shè)置參數(shù)為：源電壓20kV，激光頻率1kHz，激光能量9μJ，采用線性陽離子模式，相對分子質(zhì)量掃描范圍5000~80000，掃描速度0.5mm/s，樣本分析時間40s/孔。（3）使用校準(zhǔn)品對質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，校正通過后進(jìn)行標(biāo)本質(zhì)譜檢測，使用QuanTOF軟件進(jìn)行譜圖分析。三、方法學(xué)評價1.輕鏈的鑒定：將免疫球蛋白純品溶液IgA及IgG和健康人血清標(biāo)本用TCEP還原劑處理后獲得總輕鏈，進(jìn)行MALDI-TOFMS檢測，確定κ和λ輕鏈單電荷和雙電荷離子質(zhì)譜峰。選擇20名健康人血清標(biāo)本，按上述檢測方法，進(jìn)行MALDI-TOFMS測定，將20份κ和λ輕鏈單電荷和雙電荷離子峰譜圖疊加，驗證Kohlhagen等提出的κ和λ輕鏈離子的質(zhì)荷比范圍。2.重復(fù)性評價：（1）批內(nèi)重復(fù)性試驗：將所選M蛋白陽性、弱陽性和陰性標(biāo)本重復(fù)處理8次，即每個標(biāo)本設(shè)8個平行管，每管于靶板點樣2次，用建立的MALDI-TOFMS方法測定3份血清標(biāo)本8個平行管中M蛋白，通過8次譜圖結(jié)果疊加，評價方法的批內(nèi)重復(fù)性。（2）將所選M蛋白陽性、弱陽性和陰性樣本處理8個批次，即每批次處理3份標(biāo)本，每份標(biāo)本于靶板點樣2次，用建立的MALDI-TOFMS方法測定3份血清標(biāo)本8個批次中M蛋白，通過8次結(jié)果譜圖疊加，評價方法的批間重復(fù)性。3.質(zhì)量控制：每批次標(biāo)本測定時設(shè)置陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控。陰性質(zhì)控為經(jīng)IFE和SPE檢測為M蛋白陰性的健康人混合血清；陽性質(zhì)控為經(jīng)IFE和SPE檢測為M蛋白陽性的MM患者混合血清。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性質(zhì)控判讀以在陰性對照背景下輕鏈單電荷質(zhì)荷比范圍出現(xiàn)明顯尖峰為陽性在控；陰性質(zhì)控判讀以在上述條件下出現(xiàn)圓潤高斯分布峰為陰性在控。4.靈敏度評價：選取23份經(jīng)IFE和SPE檢測為M蛋白陽性的標(biāo)本，對每份標(biāo)本進(jìn)行10倍、100倍和200倍稀釋，采用MALDI-TOFMS對每份標(biāo)本的原倍和不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)本進(jìn)行檢測，評價所建MALDI-TOFMS方法對M蛋白的檢測限。5.方法學(xué)比對：對收集的712份血清標(biāo)本，分別采用IFE、SPE和MALDI-TOFMS3種方法進(jìn)行M蛋白檢測，進(jìn)行結(jié)果比對，計算MALDI-TOFMS方法與IFE和SPE的符合率。結(jié)果一、M蛋白的鑒定總的單克隆輕鏈可能來源于游離輕鏈也可來源于完整的免疫球蛋白，需要充分檢測所有單克隆成分，以保證方法學(xué)足夠的靈敏度和特異性，故本研究選擇總的單克隆輕鏈作為M蛋白進(jìn)行檢測。依據(jù)20份健康人血清標(biāo)本的κ和λ輕鏈單電荷和雙電荷離子峰疊加譜圖，確定κ和λ輕鏈的單電荷和雙電荷的m/z范圍，見表1，用于鑒定M蛋白。將健康對照和待測標(biāo)本進(jìn)行還原處理，測定游離和與重鏈結(jié)合的總輕鏈，將健康樣本與待測標(biāo)本譜圖進(jìn)行疊加，在輕鏈多克隆背景處見到顯著的單克隆尖峰即為M蛋白陽性，否則為陰性，見圖1。圖1

M蛋白陽性和陰性標(biāo)本譜圖（1A為κ型M蛋白質(zhì)譜圖，1B為λ型M蛋白質(zhì)譜圖，1C為陰性標(biāo)本質(zhì)譜圖）二、方法學(xué)評價1.重復(fù)性：批內(nèi)重復(fù)性：陽性、弱陽性和陰性樣本的批內(nèi)重復(fù)性一致率為100%，將每份標(biāo)本的8次重復(fù)測定結(jié)果進(jìn)行疊圖，目標(biāo)峰重合性良好，峰型一致，符合要求。批間重復(fù)性：陽性、弱陽性和陰性標(biāo)本的批間重復(fù)性一致率達(dá)100%，將每份樣本的8次批間重復(fù)測定結(jié)果進(jìn)行疊圖，目標(biāo)峰重合性良好，峰形一致，符合要求。2.靈敏度：采用MALDI-TOFMS和IFE方法分別對23例M蛋白陽性標(biāo)本的原倍、10倍稀釋、100倍稀釋和200倍稀釋樣本進(jìn)行測定，結(jié)果顯示MALDI-TOFMS在每種稀釋度下相較IFE都能以較高百分比鑒定出M蛋白，見圖2。其中，原倍時，100%的標(biāo)本都能被MALDI-TOFMS和IFE鑒定出來；10倍稀釋時，IFE可以鑒定出96%的標(biāo)本；100倍稀釋時，MALDI-TOFMS和IFE對M蛋白的檢出率分別是91%和26%；200倍稀釋時，IFE對M蛋白的檢出率不到MALDI-TOFMS的25%。其中，初始標(biāo)本的M蛋白濃度范圍為12~79g/L。基于血清M蛋白的初始值，MALDI-TOFMS和IFE對M蛋白的檢測限分別為0.06~0.18g/L和0.14~0.40g/L。圖2

MALDI-TOFMS和IFE對23份M蛋白陽性系列稀釋標(biāo)本的檢出結(jié)果三、方法學(xué)比對對收集的712份血清標(biāo)本，分別采用IFE、SPE和MALDI-TOFMS3種方法進(jìn)行M蛋白檢測，比對結(jié)果見表2。以IFE為金標(biāo)準(zhǔn)，SPE的敏感度和特異度分別為72.8%和100%，符合率為85.9%；MALDI-TOFMS的敏感度和特異度分別為99.7%和84.3%，符合率為92.3%。在M蛋白的不同型別中，MALDI-TOF-MS在IgA、IgD、IgM、游離輕鏈型和雙克隆組中對M蛋白的檢出率為100%，而SPE對IgM、IgA和游離輕鏈型標(biāo)本的檢出率分別只有66.7%、58%和19.5%；IgG組有1份陽性標(biāo)本MALDI-TOFMS未檢出。四、M蛋白檢測方法的臨床應(yīng)用在對MM隨訪患者的樣本檢測后經(jīng)查閱病歷發(fā)現(xiàn)，其中1例患者于2018年4月10日確診MM，SPE和IFE檢測M蛋白均為陽性；經(jīng)7個月治療后，M蛋白水平明顯下降，臨床評估療效為非常好的部分緩解，即VGPR；后續(xù)患者經(jīng)自體骨髓移植后，療效進(jìn)一步好轉(zhuǎn)；1年半后，患者自行停藥；停藥1個月后復(fù)查M蛋白，SPE和IFE結(jié)果仍為陰性，此時臨床評估療效為嚴(yán)格意義的完全緩解，即SCR，但MALDI-TOFMS結(jié)果為陽性；約2個半月后即2020年10月10日該患者再次復(fù)診時IFE和SPE檢測結(jié)果均轉(zhuǎn)陽，臨床評估為生化進(jìn)展，MALDI檢測仍為陽性。可以看出，在病情變化時常規(guī)方法雖檢測不到M蛋白，但MALDI-TOFMS能夠檢測到，可以提前預(yù)警M蛋白的出現(xiàn)，MALDI-TOFMS可以比IFE和/或SPE更早的檢測到M蛋白轉(zhuǎn)陽（圖3），這從臨床上驗證了MALDI-TOFMS的檢測靈敏度高于常規(guī)電泳技術(shù)。圖3

其中1例經(jīng)治療達(dá)到非常好的部分緩解患者后續(xù)M蛋白轉(zhuǎn)陽（MALDI-TOFMS比SPE和IFE提前2個半月檢測到M蛋白轉(zhuǎn)陽）討論本研究建立了一種無需抗體富集直接檢測血清M蛋白的MALDI-TOFMS方法，該法簡易、靈敏、快速、通量高、成本低，所需標(biāo)本量少（僅需2μl），便于在實驗室推廣應(yīng)用。多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病隱匿，由于缺乏典型特異癥狀，常出現(xiàn)漏診、誤診或就診時已到疾病晚期［13］。M蛋白是其特異性生物標(biāo)志物，在疾病早期對其進(jìn)行準(zhǔn)確測定對預(yù)后效果具有重要意義。選擇總輕鏈測定作為M蛋白的代表標(biāo)志物，比檢測游離輕鏈更具可行性。采用20名健康人群進(jìn)行κ和λ輕鏈的質(zhì)荷比范圍測定，與Kohlhagen等［11］報道的結(jié)果相近。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗均顯示本方法結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。對23份M蛋白陽性的樣本進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，結(jié)果顯示MALDI-TOFMS對M蛋白的檢測靈敏度高于IFE，這也解釋了我們在對712份標(biāo)本進(jìn)行檢測并與IFE結(jié)果比對時，有54份IFE結(jié)果為陰性的標(biāo)本MALDI-TOFMS檢測為陽性的現(xiàn)象。以IFE為金標(biāo)準(zhǔn)，比較MALDI-TOFMS和SPE對M蛋白的檢測能力后發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOFMS的檢出率為99.7%，遠(yuǎn)高于SPE的72.8%。尤其對于輕鏈型和IgA型M蛋白，SPE的檢出率明顯低于MALDI-TOFMS。這與文獻(xiàn)［14,

15,

16］報道的SPE的方法學(xué)局限性是一致的，說明本研究所建方法可能彌補SPE對IgA和輕鏈型M蛋白漏檢率高的缺陷。在對1例經(jīng)治療達(dá)到非常好的部分緩解患者的復(fù)診時發(fā)現(xiàn)，SPE和IFE持續(xù)保持陰性，在后續(xù)臨床評估為嚴(yán)格意義的部分緩解時，SPE和IFE依舊是陰性，而采用MALDI-TOFMS檢測為陽性，該患者在2個多月后復(fù)診，SPE和IFE結(jié)果均為陽性，臨床評估為生化進(jìn)展，此時MALDI-TOFMS仍為陽性，提示本研究所建方法可以提前預(yù)警M蛋白，由于其檢測靈敏度更高，所以可能比IFE和SPE更早地檢測到M蛋白，這將為臨床及時調(diào)整診療方案提供更有價值的診斷信息。本研究無需抗體富集采用MALDI-TOFMS方法直接檢測血清M蛋白與梅奧Murray［11］學(xué)者團(tuán)隊通過抗體富集的方法定性檢測血清M蛋白的方法學(xué)評價結(jié)果相近，甚至更優(yōu)，這大大降低了檢測成本、簡化了檢測流程，適于在臨床進(jìn)行M蛋白篩查的推廣應(yīng)用，但由于該方法為定性檢測，使其在臨床診療中發(fā)揮的應(yīng)用價值有限。為此，本研究也曾嘗試使用抗體富集進(jìn)行相對定量研究，但選用多種抗體均效果不佳，文獻(xiàn)［12］報道的抗體因無商品化供應(yīng)限制了定量研究和比對研究，后