聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟xxx公司聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟一、制膠前的準(zhǔn)備1、玻璃板的準(zhǔn)備用洗滌劑將玻璃板反復(fù)擦洗，然后用清水沖洗干凈，待玻璃板晾干后，將1mm塑料薄片沾少許清水，使其貼在玻璃板上，然后將另一塊凹行玻璃板與原玻璃板緊貼。2、垂直平板支架的安裝將準(zhǔn)備好的玻璃板，放入垂直支架內(nèi)，兩側(cè)用鋼夾使其固定，鋼夾的高度不要超過凹行玻璃的凹口處為宜，兩側(cè)選用力度大小適中、對稱的鋼夾。3、玻璃板的密封將1%瓊脂糖用微波爐加熱融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量瓊脂溶液，沿玻璃板兩邊的縫隙內(nèi)加入，使其密封，待其冷卻凝固后備用。二、凝膠的制備1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）配方：丙烯酰胺（Acr）290g甲叉雙丙烯酰胺（Bis）10g步驟：稱取樣品，倒入燒杯中用蒸餾水定容至1 L將燒杯置于攪拌器上，使溶液充分溶解至透明將完全溶解的溶液分多次過濾到棕色容器中保存?zhèn)溆?、10ｘTBE溶液的配制（1L）配方：Tris：108g；硼酸：55g；EDTANa２：步驟：稱取各成分至燒杯用蒸餾水定容至1L用玻璃棒攪拌至溶劑完全溶解分瓶倒裝待用3、PAGE凝膠的制備（一塊膠為例）配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml;10ｘTBE溶液4ml；雙蒸水16ml;20%的過硫酸銨（AP）200ul;TEMED溶液20ul步驟：將各成分稱量好之后混合好以備灌膠4、灌膠把垂直支架傾斜30°，將配好的PAGE凝膠溶液沿凹形玻璃平口處緩緩倒入至距平口7mm處為宜，倒入過程中要避免氣泡的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)有氣泡產(chǎn)生時(shí)，要待氣泡消失后再倒入。灌膠完成后，用槍吸取少量水密封膠口，壓平膠面。當(dāng)膠面與水之間有一條明顯的界限時(shí)，表示凝膠已凝固，可以開始點(diǎn)樣電泳。三、點(diǎn)樣及電泳1、ｘTBE緩沖溶液的配制量取950ml的蒸餾水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml處，裝瓶搖勻，備用。2、垂直平板電泳槽的安裝將制作好的膠放入垂直電泳槽內(nèi)，凹形玻璃向內(nèi)側(cè)。選擇合適的梳子，輕輕插入玻璃板內(nèi)，梳子底部與膠面剛好接觸為宜。將插好梳子的玻璃板緊貼電泳槽的硅膠密封圈，用鋼夾使其固定。倒入ｘTBE緩沖溶液于電泳槽內(nèi)，以剛好淹沒凹形玻璃平口為宜。3、點(diǎn)樣用微量移液器吸取1ul的溴酚藍(lán)溶液，根據(jù)PCR產(chǎn)物量大小吸取適量樣品，點(diǎn)入膠孔內(nèi)即可。每次加樣前，微量移液器要用蒸餾水清洗，以避免交叉污染。為了確保各個(gè)膠孔之間都相互隔離，在點(diǎn)樣之前可先吸取少量的溴酚藍(lán)點(diǎn)入膠孔兩端，看是否有滲漏現(xiàn)象，如果有滲漏現(xiàn)象，要重新安裝梳子。每塊膠都要點(diǎn)上maker標(biāo)記。4、電泳點(diǎn)樣結(jié)束后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至300V，90min，時(shí)間電泳時(shí)間根據(jù)PCR產(chǎn)物分子量適當(dāng)延長。四、染色、顯影1、染色液、顯色液的配制染色液：%AgNO3。AgNO31g加水至1L溶解待用。顯色液：2%NaOH。NaOH20g加水至1L溶解待用2、取膠把電泳完成后的玻璃板取下，小心拔出梳子揭去凹形玻璃，去掉底部的瓊脂凝膠，小心將膠揭下，放入染色槽中3、染色將膠用蒸餾水沖洗2次，倒入適量的染色液，以淹沒膠體為宜，計(jì)時(shí)10min4、顯影染色好的膠體，