分子生物學診斷技術進展張正北京大學人民醫(yī)院1分子生物學診斷技術進展1主要內容：分子生物學診斷技術在病原學檢測中的應用簡單介紹實驗原理以PCR、熒光實時定量PCR、NASBA為例分子診斷技術在以下病原研究的應用進展乙型肝炎丙型肝炎結核分枝桿菌2主要內容：分子生物學診斷技術在病原學檢測中的應用2病原學檢測常用的實驗室技術細胞培養(yǎng)與鑒定（“金標準”）、動物實驗血清學、免疫學診斷技術電鏡技術分子生物學診斷技術3病原學檢測常用的實驗室技術細胞培養(yǎng)與鑒定（“金標準”）、動物分子生物學診斷技術方法簡介1、主體技術具體方法舉例循環(huán)擴增PCR（聚合酶鏈反應）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，復合PCRPCR-ELISA，微孔板雜交，熒光探針標記法LCR（連接酶鏈反應）恒溫NASBA（依賴核酸序列的擴增，主要用于RNA）SDA（鏈置換擴增術）CPT（環(huán)狀探針技術）bDNA（枝鏈核酸信號放大系統(tǒng)）雜交捕獲（如：檢測HPV-DNA的試劑盒）4分子生物學診斷技術方法簡介1、主體技術具體方法舉例循分子診斷技術方法簡介2、多標靶同時檢測多重PCR毛細管電泳以測序分析為基礎的檢測技術5分子診斷技術方法簡介2、多標靶同時檢測5分子診斷技術方法簡介3、核酸雜交DNA熒光原位雜交（FISH）將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位。

線性探針分析法（LiPA）雜交保護分析法（HPA）4、質譜利用色、質譜結合PCR技術6分子診斷技術方法簡介3、核酸雜交6分子診斷的功能及擴展病原的診斷和鑒別診斷病原分型病毒載量監(jiān)測---個體化治療的依據療效及預后標志其他：病原感染中發(fā)生、發(fā)展各階段7分子診斷的功能及擴展7分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，118分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義8分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例1.---北京地壇醫(yī)院謝堯提供9分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療---北京地壇醫(yī)院謝堯提分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例2. HBV---干擾素 HBV<100pg/mL11/30陰轉 HBV>100pg/mL1/30陰轉 (HBeAgHBeAb)10分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療10分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例3. HIV病毒載量與傳播 15127人流行病學調查415對伴侶 30個月 HIV陽轉22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL全陰11分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療11分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例4. 血漿EBV載量與鼻咽癌復發(fā) 15個二年持續(xù)緩解：0copy/mL 10個復發(fā)： 32250copies/mL 17個隨訪：臨床惡化前半年病毒載量升高12分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療12耐藥病原的分子診斷WHO：人類死亡1/3是長期用藥的毒副作用HBV的YMDD變異HIV耐藥13耐藥病原的分子診斷13血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學復測：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年劍橋資料

HIV-1血清陰性而RNA陽性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200014血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學復測：14在基礎研究領域中的應用；遺傳病的基因診斷和產前基因診斷： 如血友病、地中海貧血等腫瘤基因和腫瘤標志物表達(mRNA)的檢測；骨髓移植、器官移植供體配型選擇；法醫(yī)學、動植物學、古人類學、古生物學；與疾病相關的各種蛋白（細胞因子、酶、激素、受體）的基因表達的檢測；藥物基因組學、耐藥基因的檢測，等等分子生物學技術在其它領域的應用15在基礎研究領域中的應用；分子生物學技術在其它領域的應用15簡單介紹實驗原理PCR

(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應)

熒光實時定量PCR（realtimePCR）NASBA（依賴核酸序列的擴增）16簡單介紹實驗原理PCR

(PolymeraseChainPCR原理:實質就是體外基因復制技術Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加熱變性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C17PCR原理:實質就是體外基因復制技術Mg2+dCTPdGTPPCR循環(huán)第一步–加熱變性靶序列靶序列 從外周血白細胞或絨毛、羊水細胞提取的DNA約1ug，在含有適當緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應混合物中，在94℃下熱變性1-4分鐘，使之解為單鏈。18PCR循環(huán)靶序列靶序列 從外周血白細胞或絨毛、羊水細胞提PCR循環(huán)第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物與解為單鏈的DNA上互補序列雜交在一起，稱之為退火。55℃左右19PCR循環(huán)靶序列靶序列Primer1Primer2BiPCR循環(huán)第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3’端A開始,沿著5’→3’的方向，合成每條模板的互補鏈，此稱引物延伸。72℃左右20PCR循環(huán)靶序列靶序列Primer1Primer2B第1個PCR循環(huán)完成后靶序列靶序列BiotinBiotin21第1個PCR循環(huán)完成后靶序列靶序列BiotinBioti30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2230次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli5’3’RQ探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，所以檢測不到熒光，此種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉移。熒光PCR原理–TaqManTM技術λ235’3’RQ探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR熒光PCR原理–TaqManTM技術245’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定性PCR測定的是擴增的終點（平臺期）定量PCR與定性PCR測定的區(qū)別25定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定量PCR與定性PCR測市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJopticon2伯樂icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene26市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ臨床標本核酸提取技術NASBA擴增ECL-化學發(fā)光標記檢測NASBA擴增+分子燈塔檢測擴增過程中“分子燈塔”即時同相檢測方法1-NucliSensECL方法2-NucliSensEasyQ加入裂解緩沖液和內置標準NASBA測定原理27臨床標本核酸提取技術NASBA擴增ECL-化學發(fā)光標記檢測NASBA擴增原理引物1逆轉錄酶RNaseH引物2逆轉錄酶T7RNA聚合酶引物2逆轉錄酶逆轉錄酶RNaseH引物1線性循環(huán)擴增循環(huán)28NASBA擴增原理引物1逆轉錄酶RNaseH逆轉錄酶T7NASBA和

PCR

的不同NASBA擴增目標為RNA同溫擴增連續(xù)擴增擴增物為單鏈RNA引物次序不包含於最終產物中PCR擴增目標為DNA溫度循環(huán)擴增循環(huán)擴增擴增物為雙鏈DNA引物次序包含於最終產物中

29NASBA和PCR的不同NASBAPCR29乙型肝炎檢測標志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNADane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的分子診斷30乙型肝炎檢測標志物：Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的乙型肝炎的分子診斷1.重要性全球20億人感染慢性3.5億人中國、東南亞、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌7-30％攜帶者感染變異體31乙型肝炎的分子診斷312.HBV基因型與血清型關系及流行病學分布基因型與血清型不完全一致臨床突變率不同有地域分布特點乙型肝炎的分子診斷32乙型肝炎的分子診斷32表1：基因型血清學亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Aadw2ayw132216.5％（少）C185845％（常）西歐、北歐、北美、中非、印度Badw2ayw1321550％（常）T185816％東南亞、中國、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）東南亞、中國、日本、澳洲、美國Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812％（低）地中海、俄羅斯、印度、美國33表1：基因型基因長度臨床突變率PC*BCP**Aadw232表1(續(xù)）:基因型血清學亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Eayw4321227％（中）7％（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516％（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亞GAdw23248100％（高）未定中美、美國、法國、德國Hadw43215未定未定中美、南美、美國PC**:前核心BCP**:基本核心啟動子（科華生物2004.07.21）34表1(續(xù)）:基因型基因臨床突變率PC*BCP**Eayw433.基因型與臨床實驗室表現(xiàn)不同（表2）病情與轉歸：C較B差抗病毒治療：A優(yōu)于DB優(yōu)于Cadw/ayw20:1乙型肝炎的分子診斷35乙型肝炎的分子診斷35表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴重急性加劇少多組織學活動性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突變率高低BCP雙突變率低高抗病毒治療應答好差臨床轉歸（硬化、癌變）好差36表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴重急性4.一般實驗室分型方法測序PCR-RELP（限制性片斷長度多態(tài)性）PCR核酸雜交（譜線探針法）血清學：單抗可區(qū)分A-F各基因型乙型肝炎的分子診斷37乙型肝炎的分子診斷375.抗病毒治療的耐藥性問題拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷38乙型肝炎的分子診斷38拉米夫定耐藥性的檢測耐藥性與HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸變異有關I型：YMDD變異為HBV聚合酶基因(P區(qū)基因)區(qū)第741個核苷酸位,A-G置換，使第552個密碼子蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)取代，成為YVDD變異II型：YMDD變異為P基因區(qū)743個核苷酸的G-T置換，使第55個密碼子蛋氨酸(M)被異亮氨酸(工)取代，成為YIDD變異YMDD變異：Y（酪氨酸）

M（蛋氨酸） V（纈）：YVDD變異D（天冬氨酸） I（異亮）：YIDD變異D（天冬氨酸）最近報道：YSDD（ATGAGT）應用拉米夫定耐藥位點基因芯片檢測突變位點乙型肝炎的分子診斷39拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷39乙型肝炎的分子診斷40乙型肝炎的分子診斷40乙型肝炎的分子診斷41乙型肝炎的分子診斷41HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子診斷42HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型1a,b,c,HCV基因分型方法測序型特異性引物PCR分型法線性探針雜交（InnoLipa)限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssay丙型肝炎的分子診斷43HCV基因分型方法測序丙型肝炎的分子診斷435’UTR(5’Non-CodingRegion)高度保守HCVRNA診斷實驗的常用區(qū)域有一套良好的多態(tài)性特征，因此可用于基因分型許多HCV分型商業(yè)試劑盒都采用該區(qū)進行分型TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssayVERSANTHCVGenotypingAssay(LiPA)HCVNS5B區(qū)各亞型間基因差異較大擴增效率較低若成功擴增，序列分析可區(qū)別HCV各亞型。HCV基因分型常選用的區(qū)域丙型肝炎的分子診斷445’UTR(5’Non-CodingRegion)HCV臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5’非編碼區(qū)，因為該區(qū)序列保守，檢測靈敏度高，是HCVRNA診斷實驗的常用區(qū)域。在臨床工作中，對5’UTR進行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以滿足分型的需要，為制定治療方案和判斷預后提供指導。常只需將1型和4型與其它基因型相區(qū)別，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量，因此上述的任何一種方法均可以采用。丙型肝炎的分子診斷45臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP,InnoLipHCV5’UTRgeneSecondPCRproduct=257bpSchemeACleavagewithBsrBⅠ,HinfⅠandHaeⅡ93and91bpGenotype2aand2b257bpGenotype3b,4aand5a127and91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4aand5aCleavagewithHaeⅢSchemeCCleavagewithApoⅠ183,74bp257bp4a1b197bpGenotype1a,1band6a166/169and91bpCleavagewithBstUⅠSchemeB1a227bp5aGenotype3a6a257bpHCV5’非編碼區(qū)ABC程序復合酶切分型法流程圖-北京大學人民醫(yī)院肝病研究所提供46HCV5’UTRgeneSecondPCRprodu抗HCV的確認實驗確認的重要性（灰區(qū)的遺漏）目的：解決血液篩查實驗（如ELISA）的非特異性問題方法：例如：PCR–活動性病毒血癥的檢測是一個很好的檢測方法RIBA3.0–抗體的確認新流程：丙型肝炎的分子診斷47抗HCV的確認實驗丙型肝炎的分子診斷47

抗-HCV篩查檢測報告陰性或根據S/Co比值判定為陽性所有陽性結果高S/Co比值陽性*報告低S/Co比值陽性*RIBAHCV檢測或陽性報告陰性報告不確定報告陽性陰性RIBAHCV檢測HCVRNA的NAT檢測陽性報告陰性報告不確定報告報告*以S/Co3.8(OCDHCVELISA3.0)或8.0(OCDVITROSECi/ECiQHCV)為“界值”。CDC抗-HCV實驗室檢測結果報告導則48抗-HCV篩查檢測報告陰性或根據S/Co比值判定靶序列來源:a.單抗檢出的TB抗原蛋白編碼基因b.TB特異性核酸片段克隆c.插入序列結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測實驗設計特點49靶序列來源:結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測實65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp;16sDNA，584bp.舉例結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測50舉例結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測50?標本處理：痰液化，抑制物去除?試劑質控及靈敏度注意事項結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測51?標本處理：痰液化，抑制物去除注意事項結核分枝桿菌(TB結核的PCR臨床主要應用a.結核與其他分枝桿菌區(qū)分b.結核耐藥基因c.對含菌量低的標本的分離d.為臨床可疑者捕捉信息臨床評價結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測52結核的PCR臨床主要應用臨床評價結核分枝桿菌(TB)?PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較應做比對研究臨床評價結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

TB檢測53?PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較臨床評價結核分枝桿菌(RFP（利福平）INH（異煙肼）SM（鏈霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹諾酮類已確定的耐藥的抗結核藥物結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

耐藥監(jiān)測54RFP（利福平）已確定的耐藥的抗結核藥物結核分枝桿菌(TB)單耐藥基因檢測耐利福平：突變一般發(fā)生在RNA聚合酶B亞單位編碼基因（rpoB基因）突變位點：531位絲氨酸亮氨酸 526位組氨酸酪氨酸突變導致RFP不能與RNA聚合酶B亞單位結合耐異煙肼：與三種基因突變有關katG基因（突變位點：463位精氨酸亮氨酸）inhA基因（突變位點：94位絲氨酸丙氨酸）ahpC基因結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

耐藥監(jiān)測55單耐藥基因檢測耐利福平：結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

耐同時對利福平、異煙肼這兩種或以上的抗結核藥物耐藥大多數(shù)耐多藥菌株是各種藥物作用靶分子的編碼基因逐步突變所致;靶結構變化與耐藥水平有關少數(shù)耐多藥菌株是由一個耐多藥位點的突變所致耐多藥基因檢測結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

耐藥監(jiān)測56同時對利福平、異煙肼這兩種或以上的抗結核藥物耐藥耐多藥基因檢樣品的制備PCR擴增已知的與耐藥有關的基因片段擴增產物耐藥基因分析SSCP（單鏈構象多態(tài)性分析）RFLP（限制性片段長度多態(tài)性分析）DNA序列分析耐藥基因的檢測方法結核分枝桿菌(TB)的分子診斷

耐藥監(jiān)測57樣品的制備耐藥基因的檢測方法結核分枝桿菌(TB)的分子診斷需面對的問題高費用感染與患病與傳統(tǒng)醫(yī)學的矛盾技術本身的缺陷（污染、生物安全）58需面對的問題高費用58其它需要關注的問題：標本采集、運送和保存：供分離病毒、檢出核酸及抗原的標本，要求做到：1.早：特別是對用于病毒分離、抗原或核酸檢測的標本。2.快：病毒離活體后在室溫下很易死亡，故采得標本應盡快送檢。不能及時檢測的標本應放入裝有冰塊或干冰的容器內送檢。短時間可低溫保存，凍存的標本忌反復凍融。3.近：用于病毒分離、抗原或核酸檢測的標本應盡量取自病變部位或接近病變部位(如腦炎取腦脊液，腹瀉取糞便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支氣管灌洗液，有病毒血癥時采取血液)。4.多：標本的量不能太少，如有可能一次取多種標本，在病程急性期和恢復期都取標本。5.凈：避免污染標本，特別是用于病毒分離或PCR檢測的標本實驗室生物安全保護實驗室室內、室間質量控制59其它需要關注的問題：59謝謝2007年11月60謝謝2007年11月60分子生物學診斷技術進展張正北京大學人民醫(yī)院61分子生物學診斷技術進展1主要內容：分子生物學診斷技術在病原學檢測中的應用簡單介紹實驗原理以PCR、熒光實時定量PCR、NASBA為例分子診斷技術在以下病原研究的應用進展乙型肝炎丙型肝炎結核分枝桿菌62主要內容：分子生物學診斷技術在病原學檢測中的應用2病原學檢測常用的實驗室技術細胞培養(yǎng)與鑒定（“金標準”）、動物實驗血清學、免疫學診斷技術電鏡技術分子生物學診斷技術63病原學檢測常用的實驗室技術細胞培養(yǎng)與鑒定（“金標準”）、動物分子生物學診斷技術方法簡介1、主體技術具體方法舉例循環(huán)擴增PCR（聚合酶鏈反應）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，復合PCRPCR-ELISA，微孔板雜交，熒光探針標記法LCR（連接酶鏈反應）恒溫NASBA（依賴核酸序列的擴增，主要用于RNA）SDA（鏈置換擴增術）CPT（環(huán)狀探針技術）bDNA（枝鏈核酸信號放大系統(tǒng)）雜交捕獲（如：檢測HPV-DNA的試劑盒）64分子生物學診斷技術方法簡介1、主體技術具體方法舉例循分子診斷技術方法簡介2、多標靶同時檢測多重PCR毛細管電泳以測序分析為基礎的檢測技術65分子診斷技術方法簡介2、多標靶同時檢測5分子診斷技術方法簡介3、核酸雜交DNA熒光原位雜交（FISH）將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位。

線性探針分析法（LiPA）雜交保護分析法（HPA）4、質譜利用色、質譜結合PCR技術66分子診斷技術方法簡介3、核酸雜交6分子診斷的功能及擴展病原的診斷和鑒別診斷病原分型病毒載量監(jiān)測---個體化治療的依據療效及預后標志其他：病原感染中發(fā)生、發(fā)展各階段67分子診斷的功能及擴展7分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，1168分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義8分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例1.---北京地壇醫(yī)院謝堯提供69分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療---北京地壇醫(yī)院謝堯提分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例2. HBV---干擾素 HBV<100pg/mL11/30陰轉 HBV>100pg/mL1/30陰轉 (HBeAgHBeAb)70分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療10分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例3. HIV病毒載量與傳播 15127人流行病學調查415對伴侶 30個月 HIV陽轉22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL全陰71分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療11分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例4. 血漿EBV載量與鼻咽癌復發(fā) 15個二年持續(xù)緩解：0copy/mL 10個復發(fā)： 32250copies/mL 17個隨訪：臨床惡化前半年病毒載量升高72分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療12耐藥病原的分子診斷WHO：人類死亡1/3是長期用藥的毒副作用HBV的YMDD變異HIV耐藥73耐藥病原的分子診斷13血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學復測：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年劍橋資料

HIV-1血清陰性而RNA陽性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200074血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學復測：14在基礎研究領域中的應用；遺傳病的基因診斷和產前基因診斷： 如血友病、地中海貧血等腫瘤基因和腫瘤標志物表達(mRNA)的檢測；骨髓移植、器官移植供體配型選擇；法醫(yī)學、動植物學、古人類學、古生物學；與疾病相關的各種蛋白（細胞因子、酶、激素、受體）的基因表達的檢測；藥物基因組學、耐藥基因的檢測，等等分子生物學技術在其它領域的應用75在基礎研究領域中的應用；分子生物學技術在其它領域的應用15簡單介紹實驗原理PCR

(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應)

熒光實時定量PCR（realtimePCR）NASBA（依賴核酸序列的擴增）76簡單介紹實驗原理PCR

(PolymeraseChainPCR原理:實質就是體外基因復制技術Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加熱變性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C77PCR原理:實質就是體外基因復制技術Mg2+dCTPdGTPPCR循環(huán)第一步–加熱變性靶序列靶序列 從外周血白細胞或絨毛、羊水細胞提取的DNA約1ug，在含有適當緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應混合物中，在94℃下熱變性1-4分鐘，使之解為單鏈。78PCR循環(huán)靶序列靶序列 從外周血白細胞或絨毛、羊水細胞提PCR循環(huán)第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物與解為單鏈的DNA上互補序列雜交在一起，稱之為退火。55℃左右79PCR循環(huán)靶序列靶序列Primer1Primer2BiPCR循環(huán)第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3’端A開始,沿著5’→3’的方向，合成每條模板的互補鏈，此稱引物延伸。72℃左右80PCR循環(huán)靶序列靶序列Primer1Primer2B第1個PCR循環(huán)完成后靶序列靶序列BiotinBiotin81第1個PCR循環(huán)完成后靶序列靶序列BiotinBioti30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon8230次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli5’3’RQ探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，所以檢測不到熒光，此種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉移。熒光PCR原理–TaqManTM技術λ835’3’RQ探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR熒光PCR原理–TaqManTM技術845’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定性PCR測定的是擴增的終點（平臺期）定量PCR與定性PCR測定的區(qū)別85定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定量PCR與定性PCR測市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJopticon2伯樂icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene86市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ臨床標本核酸提取技術NASBA擴增ECL-化學發(fā)光標記檢測NASBA擴增+分子燈塔檢測擴增過程中“分子燈塔”即時同相檢測方法1-NucliSensECL方法2-NucliSensEasyQ加入裂解緩沖液和內置標準NASBA測定原理87臨床標本核酸提取技術NASBA擴增ECL-化學發(fā)光標記檢測NASBA擴增原理引物1逆轉錄酶RNaseH引物2逆轉錄酶T7RNA聚合酶引物2逆轉錄酶逆轉錄酶RNaseH引物1線性循環(huán)擴增循環(huán)88NASBA擴增原理引物1逆轉錄酶RNaseH逆轉錄酶T7NASBA和

PCR

的不同NASBA擴增目標為RNA同溫擴增連續(xù)擴增擴增物為單鏈RNA引物次序不包含於最終產物中PCR擴增目標為DNA溫度循環(huán)擴增循環(huán)擴增擴增物為雙鏈DNA引物次序包含於最終產物中

89NASBA和PCR的不同NASBAPCR29乙型肝炎檢測標志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNADane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的分子診斷90乙型肝炎檢測標志物：Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的乙型肝炎的分子診斷1.重要性全球20億人感染慢性3.5億人中國、東南亞、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌7-30％攜帶者感染變異體91乙型肝炎的分子診斷312.HBV基因型與血清型關系及流行病學分布基因型與血清型不完全一致臨床突變率不同有地域分布特點乙型肝炎的分子診斷92乙型肝炎的分子診斷32表1：基因型血清學亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Aadw2ayw132216.5％（少）C185845％（常）西歐、北歐、北美、中非、印度Badw2ayw1321550％（常）T185816％東南亞、中國、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）東南亞、中國、日本、澳洲、美國Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812％（低）地中海、俄羅斯、印度、美國93表1：基因型基因長度臨床突變率PC*BCP**Aadw232表1(續(xù)）:基因型血清學亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Eayw4321227％（中）7％（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516％（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亞GAdw23248100％（高）未定中美、美國、法國、德國Hadw43215未定未定中美、南美、美國PC**:前核心BCP**:基本核心啟動子（科華生物2004.07.21）94表1(續(xù)）:基因型基因臨床突變率PC*BCP**Eayw433.基因型與臨床實驗室表現(xiàn)不同（表2）病情與轉歸：C較B差抗病毒治療：A優(yōu)于DB優(yōu)于Cadw/ayw20:1乙型肝炎的分子診斷95乙型肝炎的分子診斷35表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴重急性加劇少多組織學活動性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突變率高低BCP雙突變率低高抗病毒治療應答好差臨床轉歸（硬化、癌變）好差96表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴重急性4.一般實驗室分型方法測序PCR-RELP（限制性片斷長度多態(tài)性）PCR核酸雜交（譜線探針法）血清學：單抗可區(qū)分A-F各基因型乙型肝炎的分子診斷97乙型肝炎的分子診斷375.抗病毒治療的耐藥性問題拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷98乙型肝炎的分子診斷38拉米夫定耐藥性的檢測耐藥性與HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸變異有關I型：YMDD變異為HBV聚合酶基因(P區(qū)基因)區(qū)第741個核苷酸位,A-G置換，使第552個密碼子蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)取代，成為YVDD變異II型：YMDD變異為P基因區(qū)743個核苷酸的G-T置換，使第55個密碼子蛋氨酸(M)被異亮氨酸(工)取代，成為YIDD變異YMDD變異：Y（酪氨酸）

M（蛋氨酸） V（纈）：YVDD變異D（天冬氨酸） I（異亮）：YIDD變異D（天冬氨酸）最近報道：YSDD（ATGAGT）應用拉米夫定耐藥位點基因芯片檢測突變位點乙型肝炎的分子診斷99拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷39乙型肝炎的分子診斷100乙型肝炎的分子診斷40乙型肝炎的分子診斷101乙型肝炎的分子診斷41HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子診斷102HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型1a,b,c,HCV基因分型方法測序型特異性引物PCR分型法線性探針雜交（InnoLipa)限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssay丙型肝炎的分子診斷103HCV基因分型方法測序丙型肝炎的分子診斷435’UTR(5’Non-CodingRegion)高度保守HCVRNA診斷實驗的常用區(qū)域有一套良好的多態(tài)性特征，因此可用于基因分型許多HCV分型商業(yè)試劑盒都采用該區(qū)進行分型TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssayVERSANTHCVGenotypingAssay(LiPA)HCVNS5B區(qū)各亞型間基因差異較大擴增效率較低若成功擴增，序列分析可區(qū)別HCV各亞型。HCV基因分型常選用的區(qū)域丙型肝炎的分子診斷1045’UTR(5’Non-CodingRegion)HCV臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5’非編碼區(qū)，因為該區(qū)序列保守，檢測靈敏度高，是HCVRNA診斷實驗的常用區(qū)域。在臨床工作中，對5’UTR進行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以滿足分型的需要，為制定治療方案和判斷預后提供指導。常只需將1型和4型與其它基因型相區(qū)別，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量，因此上述的任何一種方法均可以采用。丙型肝炎的分子診斷105臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP,InnoLipHCV5’UTRgeneSecondPCRproduct=257bpSchemeACleavagewithBsrBⅠ,HinfⅠandHaeⅡ93and91bpGenotype2aand2b257bpGenotype3b,4aand5a127and91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4aand5aCleavagewithHaeⅢSchemeCCleavagewithApoⅠ183,74bp257bp4a1b197bpGenotype1a,1band6a166/169and91bpCleavagewithBstUⅠSchemeB1a227bp5aGenotype3a6a257bpHCV5’非編碼區(qū)ABC程序復合酶切分型法流程圖-北京大學人民醫(yī)院肝病研究所提供106HCV5’UTRgeneSecondPCRprodu抗HCV的確認實驗確認的重要性（灰區(qū)的遺漏）目的：解決血液篩查實驗（如ELISA）的非特異性問題方法：例如：PCR–活動性病毒血癥的檢測是一個很好的檢測方法RIBA3.0–抗體的確認新流程：丙型肝炎的分子診斷107抗HCV的確認實驗丙型肝炎的分子診斷47

抗-HCV篩查檢測報告陰性或根據S/Co比值判定為陽性所有陽性結果高S/Co比值陽性*報告低S