生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重組和重組DNA技術(shù)第二十一章DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過(guò)程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過(guò)程。DNA重組（DNArecombination）是指不同DN第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombinationandGeneTransferinNature第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombiDNA重組同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)DNA重組同源重組(homologousrecombin發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型一、同源重組是最基本的DNA重組方式發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrHolliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排片段重組體（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體（見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。

片段重組體（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：拼接重組體（見(jiàn)模型圖右邊參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識(shí)別Holliday連接點(diǎn)，并有選擇地切開(kāi)同源重組體的中間體。參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合位點(diǎn)特異重組(λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-免疫球蛋白基因重排過(guò)程免疫球蛋白基因重排過(guò)程三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因插入序列(insertionsequences,IS插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移

細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L

由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的?。ǘ┺D(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNA重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門(mén)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。DNA克隆重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）

技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。╩olecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因工程（geneticengineering）技術(shù)其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）目的：一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③

DNA序列分析；④填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類(lèi)核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列,并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonucle與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類(lèi)：作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；命名：HindⅢⅡ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同裂酶：來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體

定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達(dá)載體(expressionvector)

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體定義載體按克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)表達(dá)載體(expre（一）克隆載體至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增；至少有一個(gè)選擇標(biāo)志（selectionmarker）：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的RE的單一切點(diǎn)：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)RE的單一切點(diǎn)，可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）。1.克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn)

（一）克隆載體至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)（1）質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。2.常用的克隆載體

（1）質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主DNA重組及重組DNA技術(shù)課件pUC18質(zhì)粒載體圖譜pUC18質(zhì)粒載體圖譜

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?）噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)（2）噬菌體(phage)柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）（3）其他克?。ǘ┍磉_(dá)載體表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。根據(jù)宿主細(xì)胞分為：原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體（二）表達(dá)載體表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體1.原核表達(dá)載體

原核表達(dá)載體的基本組成

R：調(diào)節(jié)序列；P：?jiǎn)?dòng)子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列1.原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體2.真核表達(dá)載體

真核表達(dá)載體的基本組成

OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)；

TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。2.真核表達(dá)載體第三節(jié)重組DNA技術(shù)基本原理和操作步驟第三節(jié)基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過(guò)程以（一）目的基因的分離獲取——分化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。從基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)中獲取目的DNA(見(jiàn)第20章)PCR法(見(jiàn)第20章)其他方法(見(jiàn)第20章)（一）目的基因的分離獲取——分化學(xué)合成法化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列?；瘜W(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscmRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子（二）載體的選擇與構(gòu)建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。

目的：①獲得某一目的基因或DNA片段②獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)（二）載體的選擇與構(gòu)建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細(xì)菌黏粒~50kb細(xì)菌BAC~400kb細(xì)菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接（2）不同黏端連接

（3）通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接

黏端連接（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連單一相同黏端連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同黏端連接（定向克?。〦coRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體不同黏端連接（定向克?。〦coRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。

同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶PCR法針對(duì)目的DNA的5-和3-端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在每條引物的5-端分別加上不同的RE位點(diǎn)，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應(yīng)RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。PCR法針對(duì)目的DNA的5-和3-端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：平端連接限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體3.粘-平末端連接黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過(guò)一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。

屬于定向克隆3.粘-平末端連接黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞——轉(zhuǎn)受體菌條件：導(dǎo)入方式：（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞——轉(zhuǎn)1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

(1)利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達(dá)特性篩選(3)利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選（五）重組體的篩選與鑒定——篩1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選（五）重組體的篩選與鑒定2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸雜交法(4)DNA測(cè)序法

3.親和篩選法2.序列特異性篩選插入失活篩選帶有重組載體的克隆插入失活篩選帶有重組載體的克隆α互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）α互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）菌落或噬斑原位雜交篩選重組體菌落或噬斑原位雜交篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：小結(jié)分分離獲取目的基因選載體的選擇與構(gòu)建接目的DNA與載體連接

轉(zhuǎn)重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩重組體的篩選與鑒定重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：小結(jié)分分離獲取目的基因重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源表達(dá)體系的建立：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立：（六）克隆基因的表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)

E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1.原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用)標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子1.原核

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)

轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞）優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA轉(zhuǎn)染——第三節(jié)

重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ApplicationofRecombinantDNATechnologyinMedicine第三節(jié)ApplicationofRecombinant一、重組DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。美國(guó)EliLilly公司于1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng)，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開(kāi)始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。一、重組DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類(lèi)白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激二、重組DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的其他諸多方面

疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定轉(zhuǎn)基因和基因打靶加速了人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成疾病的基因診斷和基因治療二、重組DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的其他諸多方面疾病相關(guān)基因演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重組和重組DNA技術(shù)第二十一章DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過(guò)程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過(guò)程。DNA重組（DNArecombination）是指不同DN第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombinationandGeneTransferinNature第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombiDNA重組同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)DNA重組同源重組(homologousrecombin發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型一、同源重組是最基本的DNA重組方式發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrHolliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排片段重組體（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體（見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。

片段重組體（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：拼接重組體（見(jiàn)模型圖右邊參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識(shí)別Holliday連接點(diǎn)，并有選擇地切開(kāi)同源重組體的中間體。參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合位點(diǎn)特異重組(λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-免疫球蛋白基因重排過(guò)程免疫球蛋白基因重排過(guò)程三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因插入序列(insertionsequences,IS插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移

細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L

由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)?？山雍腺|(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的?。ǘ┺D(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNA重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門(mén)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。DNA克隆重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）

技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。╩olecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因工程（geneticengineering）技術(shù)其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）目的：一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③

DNA序列分析；④填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類(lèi)核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列,并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonucle與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類(lèi)：作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；命名：HindⅢⅡ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同裂酶：來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體

定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達(dá)載體(expressionvector)

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體定義載體按克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)表達(dá)載體(expre（一）克隆載體至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增；至少有一個(gè)選擇標(biāo)志（selectionmarker）：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的RE的單一切點(diǎn)：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)RE的單一切點(diǎn)，可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）。1.克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn)

（一）克隆載體至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)（1）質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。2.常用的克隆載體

（1）質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主DNA重組及重組DNA技術(shù)課件pUC18質(zhì)粒載體圖譜pUC18質(zhì)粒載體圖譜

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）（2）噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)（2）噬菌體(phage)柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）（3）其他克隆（二）表達(dá)載體表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。根據(jù)宿主細(xì)胞分為：原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體（二）表達(dá)載體表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體1.原核表達(dá)載體

原核表達(dá)載體的基本組成

R：調(diào)節(jié)序列；P：?jiǎn)?dòng)子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列1.原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體2.真核表達(dá)載體

真核表達(dá)載體的基本組成

OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)；

TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。2.真核表達(dá)載體第三節(jié)重組DNA技術(shù)基本原理和操作步驟第三節(jié)基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過(guò)程以（一）目的基因的分離獲取——分化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。從基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)中獲取目的DNA(見(jiàn)第20章)PCR法(見(jiàn)第20章)其他方法(見(jiàn)第20章)（一）目的基因的分離獲取——分化學(xué)合成法化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列?；瘜W(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscmRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子（二）載體的選擇與構(gòu)建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。

目的：①獲得某一目的基因或DNA片段②獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)（二）載體的選擇與構(gòu)建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細(xì)菌黏粒~50kb細(xì)菌BAC~400kb細(xì)菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接（2）不同黏端連接

（3）通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接

黏端連接（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連單一相同黏端連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同黏端連接（定向克?。〦coRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體不同黏端連接（定向克?。〦coRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。

同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(term