目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"微生物鑒定技術(shù)—傳統(tǒng)方法1細(xì)菌微菌落技術(shù)1生理生化反應(yīng)特征1生態(tài)學(xué)特征2血清學(xué)反應(yīng)2選擇、鑒定用培養(yǎng)基法3微量多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)鑒定系統(tǒng)3\o"CurrentDocument"微生物鑒別方法—新技術(shù)新方法3細(xì)胞壁組分分析3\o"CurrentDocument"2.2紅外光譜IR3\o"CurrentDocument"2.3氣相色譜GC4\o"CurrentDocument"2.4高效液相色譜HPLC4\o"CurrentDocument"2.5質(zhì)譜分析MS4\o"CurrentDocument"微生物鑒別方法—分子生物學(xué)方法43.1分子生物學(xué)技術(shù)4\o"CurrentDocument"PCR技術(shù)4基因探針技術(shù)4\o"CurrentDocument"16SrDNA基因同源性分析5蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2014屆研究生發(fā)酵工程原理作業(yè)蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2014屆研究生發(fā)酵工程原理作業(yè)微生物的鑒定方法微生物鑒定技術(shù)—傳統(tǒng)方法在傳統(tǒng)的分類鑒定中，微生物分類鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)特征、生態(tài)學(xué)特征以及血清學(xué)反應(yīng)、對噬菌體的敏感性等。在鑒定時，我們把這些依據(jù)作為鑒定項(xiàng)目，進(jìn)行一系列的觀察和鑒定工作。1.1細(xì)菌微菌落技術(shù)細(xì)菌的形態(tài)、大小、顏色及其它特征與細(xì)菌的基本生物學(xué)特性如代謝類型、分裂方式、繁殖速度等有密切關(guān)系。肉眼所見菌落，即大菌落是由大量的菌體緊密堆積而成，有不少生物學(xué)特性不能辨別；微菌落則是指細(xì)菌生長繁殖早期在固相載體上形成的只能借助顯微鏡進(jìn)行觀察的細(xì)菌集落。與大菌落相比，微菌落邊緣及中央有明顯不同的表形特征。可據(jù)此對微生物的種類進(jìn)行鑒定。缺點(diǎn)：受操作人員主觀性影響大。（1）細(xì)胞形態(tài)在顯微鏡下觀察細(xì)胞外形大小、形狀、排列等，細(xì)胞構(gòu)造，革蘭氏染色反應(yīng)，能否運(yùn)動、鞭毛著生部位和數(shù)目，有無芽孢和莢膜、芽孢的大小和位置，放線菌和真菌的繁殖器官的形狀、構(gòu)造，孢子的數(shù)目、形狀、大小、顏色和表面特征等。（2）群體形態(tài)群體形態(tài)通常是指以下情況的特征：在一定的固體培養(yǎng)基上生長的菌落特征，包括外形、大小、光澤、黏稠度、透明度、邊緣、隆起情況、正反面顏色、質(zhì)地、氣味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培養(yǎng)基上生長的菌苔特征，包括生長程度、形狀、邊緣、隆起、顏色等；在半固體培養(yǎng)基上經(jīng)穿刺接種后的生長情況；在液體培養(yǎng)基中生長情況，包括是否產(chǎn)生菌膜，均勻渾濁還是發(fā)生沉淀，有無氣泡，培養(yǎng)基的顏色等。如是酵母菌，還要注意是成醭狀、環(huán)狀還是島狀。1.2生理生化反應(yīng)特征1）利用物質(zhì)的能力包括對各種碳源利用的能力（能否以CO2為唯一碳源、各種糖類的利用情況等）、對各種氮源的利用能力（能否固氮、硝酸鹽和銨鹽利用情況等）、能源的要求（光能還是化能、氧化無機(jī)物還是氧化有機(jī)物等）、對生長因子的要求（是否需要生長因子以及需要什么生長因子等）。（2）代謝產(chǎn)物的特殊性這方面的鑒定項(xiàng)目非常多，如是否產(chǎn)生H2S、吲哚、CO2、醇、有機(jī)酸，能否還原硝酸鹽，能否使牛奶凝固、凍化等。（3）與溫度和氧氣的關(guān)系測出適合某種微生物生長的溫度范圍以及它的最適生長溫度、最低生長溫度和最高生長溫度。對氧氣的關(guān)系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧還是專性厭氧。生態(tài)學(xué)特征生態(tài)學(xué)特征主要包括它與其他生物之間的關(guān)系（是寄生還是共生，寄主范圍以及致病的情況）。在自然界的分布情況（pH情況、水分程度等）、滲透壓情況（是否耐高滲、是否有嗜鹽性等）。血清學(xué)反應(yīng)很多細(xì)菌有十分相似的外表結(jié)構(gòu)（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸桿菌屬內(nèi)各種細(xì)菌都有乳酸脫氫酶）。雖然它們的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)各異，但在普通技術(shù)下（如電子顯微鏡或生化反應(yīng)），仍無法分辨它們。然而利用抗原與抗體的高度敏感特異性反應(yīng)，就可用來鑒別相似的菌種，或?qū)νN微生物分型。用已知菌種、型或菌株制成的抗血清，與待鑒定的對象是否發(fā)生特異性的血清學(xué)反應(yīng)來鑒定未知菌種、型或菌株。該法常用于腸道菌、噬菌體和病毒的分類鑒定。利用此法，已將傷寒桿菌、肺炎鏈球菌等菌分成數(shù)十種菌型。選擇、鑒定用培養(yǎng)基法在培養(yǎng)基中加入特異性的生化反應(yīng)底物、抗體、熒光反應(yīng)底物、酶反應(yīng)底物等，可使目標(biāo)培養(yǎng)物的選擇、分離、鑒定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF（兔血漿+纖維蛋白原）培養(yǎng)基，可在24h內(nèi)鑒定金黃色葡萄球菌。微量多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)鑒定系統(tǒng)該系統(tǒng)的原理是根據(jù)微生物生理生化特征鑒定的結(jié)果，所進(jìn)行的數(shù)碼分類鑒定。它是針對微生物的生理生化特性，配制各種底物、培養(yǎng)基、試劑等，分別微量加入各個分隔室中，冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分室在同一塑料條或板上構(gòu)成檢測卡。在未知菌加入其中檢測后，通過查檢索表或直接輸入計算機(jī)得到鑒定結(jié)果。最短甚至能在2-4h出結(jié)果。微生物多項(xiàng)鑒定技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，能快速、敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的鑒定微生物，缺點(diǎn)是各系統(tǒng)差異較大，有的價格昂貴，有的個別反應(yīng)不準(zhǔn)。但毫無疑問，它是微生物鑒定技術(shù)向快速、簡易和自動化發(fā)展的重要方向之一。微生物鑒別方法—新技術(shù)新方法2.1細(xì)胞壁組分分析細(xì)胞壁組分分析首先應(yīng)用于放線菌分類中，把它作為區(qū)分“屬”的依據(jù)之一。它比單純用形態(tài)進(jìn)行分類更全面。近年來，有人對18個屬的放線菌的細(xì)胞壁進(jìn)行了分析，根據(jù)細(xì)胞壁的氨基酸組成，將其分為6個細(xì)胞壁類型，又根據(jù)細(xì)胞壁的糖的組成分成4個糖類型，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合形態(tài)特征提出了相應(yīng)的科屬檢索表。2.2紅外光譜IR一般認(rèn)為，每種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)都有特定的紅外光譜。若兩個樣品的吸收光譜完全相同，可以初步認(rèn)為它們是同一種物質(zhì)。因此，紅外光譜技術(shù)被應(yīng)用到微生物的分類中。它先后對芽孢桿菌、乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌進(jìn)行分類，近年來又應(yīng)用于放線菌分類中。根據(jù)有關(guān)學(xué)者的試驗(yàn)表明，這種方法簡便快速，樣品少，結(jié)果較好，不僅可以初步了解各屬菌的細(xì)胞成分的化學(xué)性質(zhì)，同時也有助于微生物間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的探索。但是它也有不足之處，借助于紅外線光譜區(qū)分屬內(nèi)的種和菌株是困難的，但可以作為“屬”的分類特征。2.3氣相色譜GC2.4高效液相色譜HPLC2.5質(zhì)譜分析MS微生物鑒別方法—分子生物學(xué)方法3.1分子生物學(xué)技術(shù)以上幾種都是應(yīng)用細(xì)菌的表現(xiàn)特性（包括形態(tài)、生理、生化、血清等）進(jìn)行鑒定。雖然這種方法很成功，但對十分相似的細(xì)菌卻難以區(qū)別。進(jìn)二十年來，核酸技術(shù)應(yīng)用于分類鑒定已成為發(fā)展趨勢。3.2PCR技術(shù)PCR技術(shù)采用體外酶促反應(yīng)合成特異性DNA片段，再通過擴(kuò)增產(chǎn)物來識別細(xì)菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個拷貝的基因，因此在細(xì)菌的檢測中只需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進(jìn)行篩選，節(jié)約了大量時問，但PCR技術(shù)缺點(diǎn)：增菌培養(yǎng)基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有作用，可能導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果假陰性；微量的外源性DNA進(jìn)入PCR后可以引起無限大產(chǎn)生假陽性結(jié)果；擴(kuò)增過程中有一定的裝配誤差會對結(jié)果產(chǎn)生影響。3.3基因探針技術(shù)基因探針技術(shù)利用具有同源性序列的核酸單鏈在適當(dāng)條件下互補(bǔ)形成穩(wěn)定的DNARNA或DNADNA鏈的原理，采用高度特異性基因片段制備基因探針來識別細(xì)菌?；蛱结樀膬?yōu)點(diǎn)是減少了基因片段長度多態(tài)性所需要分析的條帶數(shù)。如法國生物一梅里埃公司的基因探針檢測系統(tǒng)，30min完成微生物的確證試驗(yàn)，基因探針的缺點(diǎn)是不能鑒定目標(biāo)菌以外的其他菌。3.416SrDNA基因同源性分析16SrDNA基因同源性分析是一種常用的細(xì)菌分子鑒定方法，16SrDNA基因的擴(kuò)增需要細(xì)菌染色體DNA作為模板。目前建立了1種新的快速高效的細(xì)菌染色體DNA提取方法，整個提取過程僅耗時2min，從而使得細(xì)菌的快速鑒定成為可能。當(dāng)前制藥企業(yè)中應(yīng)有較多的是表型鑒定的一些系統(tǒng)，但隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，微生物鑒定正經(jīng)歷由表現(xiàn)型向基因型鑒定轉(zhuǎn)變的過程。近年來興起的基因探針技術(shù)及全自動微生物檢測系統(tǒng)，