本文格式為Word版，下載可任意編輯——山羊絨DNA的提取及驗(yàn)證

材料與儀器

1.1試劑

試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格，組織和毛發(fā)提取試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0（TaKaRaCode.9765），PremixExTaq?（ProbeqPCR）（TaKaRaCode.RR390A），100%乙醇，DNALaddarMarker。

1.2儀器與設(shè)備

冰箱：4℃～20℃，天平：感量0.0001g，分析研磨機(jī)，剪刀，恒溫水浴鍋，離心機(jī)（12000rpm），渦旋混合器，微量可調(diào)移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，1.5mL離心管，超凈工作臺(tái)，PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，電泳裝置，凝膠成像儀。

2試驗(yàn)方法與步驟

2.1取樣

從山羊絨制品的不用部位取樣，共取約1g試樣。

2.2制樣

用剪刀將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機(jī)打散混勻，再用剪刀盡量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨機(jī)混勻。

2.3DNA的提取

從混勻的樣品中稱取約5mg試樣，放入2mL離心管中，每個(gè)樣平行提取兩管，提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書舉行操作，此處不贅述。提取過程留神如殘存纖維狀組織無(wú)法完全裂解，裂解之后先12000rpm離心2分鐘，去除雜質(zhì)之后再舉行后續(xù)操作。提取試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司供給，試劑盒型號(hào)TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0。

2.4引物探針信息

本文所用的引物和探針均由TakaRa寶生物工程（大連）有限公司合成，概括見表1。

表1山羊絨成分熒光定量PCR引物及探針

3結(jié)果與分析

3.1DNA提取效果

DNA提取終止后對(duì)其舉行DNA電泳以確保其DNA的提出，概括結(jié)果見圖1。由圖1可見，提取的DNA擴(kuò)增條帶明顯，提取效果良好。

圖1提取山羊絨DNA電泳圖

2μLApplied，1%Agarose;M：DNAMarkerλ-HindIIIdigest;1-2：山羊絨DNA

3.2引物特異性驗(yàn)證

在優(yōu)化好的PCR回響條件和回響體系下，以鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)對(duì)照舉行PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，僅有山羊絨被擴(kuò)增出條帶，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，證明山羊絨引物的特異性良好，將其應(yīng)用于PCR方法，山羊絨成分可以從其他纖維中有效地鑒別出來(lái)，概括結(jié)果見圖2。圖2所顯示的擴(kuò)增片段大小約是300bp，大小符合所設(shè)計(jì)的引物片段大小303bp，且陰性對(duì)照和其他非山羊絨模板對(duì)照均未展現(xiàn)特異性條帶。

12345678M

圖2PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

5μLApplied，3%Agarose，M：100bpDNALaddarMarker;1：鴨絨PCR產(chǎn)物;2：鵝絨PCR產(chǎn)物;3：綿羊毛PCR產(chǎn)物;4：兔毛PCR產(chǎn)物;5：山羊絨PCR產(chǎn)物;6：牦牛絨PCR產(chǎn)物;7：羊駝毛PCR產(chǎn)物;8：陰性對(duì)照（NegativeControl）。

3.3檢測(cè)體系及結(jié)果

3.3.1回響體系及回響條件

（1）PCR回響體系

以提取的山羊絨DNA為模板，每次回響均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光PCR回響體系25μL，概括見表2。

表2熒光定量PCR回響體系

注：Negativecontrol回響時(shí)，參與RNasefreedH2O;Positive回響時(shí)，做兩個(gè)平行樣。

（2）回響條件

本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR初步回響參數(shù)包括預(yù)變性、變性、退火延遲三步。實(shí)時(shí)熒光定量PCR初步回響參數(shù)見表3。

表3熒光定量回響條件參數(shù)

ABI7500FastRealTimeSystem熒光定量PCR儀完全封閉操作，儀器可以直接讀數(shù)，熒光定量PCR熒信號(hào)在每一循環(huán)延遲步驟完成后收集，并立刻顯示出結(jié)果，可實(shí)時(shí)查看每一循環(huán)收集熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

3.3.2檢測(cè)結(jié)果

（1）Ct值及結(jié)果判定

在優(yōu)化好的熒光PCR回響條件和回響體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)的對(duì)照來(lái)舉行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，僅山羊絨Ct值為26.125，而其他樣品及陰性對(duì)照無(wú)Ct值，Ct值及結(jié)果判定見表4。

（2）熒光PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

在優(yōu)化好的熒光PCR回響條件和回響體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)的對(duì)照來(lái)舉行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，僅山羊絨有擴(kuò)增曲線，而其他對(duì)照以及空白對(duì)照均沒有擴(kuò)增曲線，說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針與山羊基因具有較高同源性，而與其他常見動(dòng)物物種的基因并沒有同源性，該檢測(cè)方法具較強(qiáng)的特異性。概括結(jié)果見圖3。

圖3山羊絨DNA熒光PCR結(jié)果

4結(jié)論

本文使用TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0試劑盒提取山羊絨DNA，經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，DNA擴(kuò)增曲線良好，電泳條帶明顯，空白對(duì)照是陰性結(jié)果，引物對(duì)在其他幾種動(dòng)物纖維體系內(nèi)，包含鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、牦牛絨和羊駝毛，沒有擴(kuò)增。引物