甘草皂苷的提取方法和含量測(cè)定研究概況張建剛

化工與制藥專(zhuān)業(yè)化工與制藥1205班學(xué)號(hào)120150121

指導(dǎo)老師劉雪凌講師摘要本文綜述了甘草中有效成分甘草皂昔的提取和測(cè)定方法的研究概況。稀醇溶液對(duì)甘草酸的提取效果較好，添加稀氨水后可提高甘草皂昔的提取收率；超聲波強(qiáng)化或微波輔助提取可提高甘草皂昔的提取效率并節(jié)約提取溶劑和提取時(shí)間,CO2超臨界流體法無(wú)毒、高效且不需加熱即可將甘草皂苷與溶質(zhì)分離開(kāi)來(lái);TLC,HPLC,CE方法可實(shí)現(xiàn)甘草皂昔含量的快速、準(zhǔn)確測(cè)定。關(guān)鍵詞甘草甘草皂昔提取測(cè)定概況甘草是我國(guó)常用的中草藥品種之一，除主要醫(yī)藥用外，還廣泛地應(yīng)用于煙草、食品、釀造以及化妝品工業(yè)等領(lǐng)域［1］。甘草的主要有效成分為甘草皂苷(glycyrrhizicacid)或甘草甜素(glycyrrhizin)及甘草次酸(glycyrrhetinicacid)等三萜類(lèi)化合物、甘草黃酮類(lèi)化合物以及甘草多糖等⑵。藥理研究表明，甘草酸及甘草次酸具有解毒、消炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的作用，近年來(lái)，還用于防治病毒性肝炎、癌癥以及艾滋病等3］。甘草酸及甘草次酸的提取和含量的測(cè)定在甘草研究中具有舉足輕重的地位。我國(guó)雖是甘草生產(chǎn)和出口的大國(guó)，但對(duì)甘草主要有效成分甘草酸的生物合成、作用機(jī)制、精制加工和綜合利用的深入研究還落后于日本等國(guó)。受技術(shù)條件和工藝限制，應(yīng)用傳統(tǒng)方法提取的甘草酸粗品的純度低，在國(guó)際市場(chǎng)上的價(jià)格低，并且提取效率也低，對(duì)甘草資源的利用不充分，影響了我國(guó)甘草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外涌現(xiàn)出許多先進(jìn)的提取技術(shù)(如超臨界流體提取法、微波輔助提取法等)，以及高效靈敏的測(cè)定方法(如高效液相色譜、毛細(xì)管電泳⑷等)，對(duì)這一領(lǐng)域研究的一些進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)單的概括，希望有助于我國(guó)甘草的研究和利用開(kāi)發(fā)。1甘草酸粗提液的制備方法1.1傳統(tǒng)提取方法從甘草及其制品中提取甘草皂苷的傳統(tǒng)方法包括室溫冷浸法、滲漉法、煎煮和熱回流法以及索氏(Soxhlet)提取法。室溫冷浸法是在室溫條件下，將過(guò)一定目數(shù)篩的甘草粉末直接加入到適當(dāng)容器中，加入適當(dāng)比例的水、氨水或醇等溶劑浸提，其提取的效率較低，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng);滲漉法需要使用特制的滲漉設(shè)備，不斷加入溶劑，使與滲出液一直保持相當(dāng)?shù)臐舛炔?，提取效率較冷浸法高，但與冷浸法一樣提取時(shí)間較長(zhǎng)，溶劑消耗量較大;煎煮和熱回流法是通過(guò)加熱處理，增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度，熱回流法避免了乙醇等低沸點(diǎn)溶劑的揮發(fā)損失，提取效率較高;索氏(Soxhlet)提取法又稱(chēng)連續(xù)回流提取法，其利用索氏提取器對(duì)甘草粉末進(jìn)行提取，加熱蒸發(fā)的溶劑經(jīng)冷凝后又回到樣品管中，經(jīng)約10個(gè)循環(huán)后，基本可將甘草中的甘草酸提取完全，提取效率較高，同時(shí)節(jié)省了溶劑，但時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。超聲強(qiáng)化提取法(ultrasoundwaveextraction,UE)超聲波的頻率為20kHz,通過(guò)超聲波的空化作用產(chǎn)生極大的壓力，造成細(xì)胞壁的破裂，并在瞬間完成，同時(shí)產(chǎn)生的振動(dòng)作用一起強(qiáng)化了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)展和溶解，加速了樣品中組分的溶出，提取效率較高，時(shí)間較短。趙茜等［5］以氨水為溶劑研究了超聲介入強(qiáng)化提取甘草酸的作用效果，通過(guò)對(duì)施加超聲場(chǎng)的功率、溫度、浸漬時(shí)間、pH以及攪拌速率等參數(shù)進(jìn)行了研究，認(rèn)為與未施加超聲場(chǎng)的傳統(tǒng)方法相比，超聲輔助提取可顯著縮短提取時(shí)間，并獲得較高的提取率。微波輔助提取法(microwave2assistedextraction,MAE)利用微波強(qiáng)化固液浸取過(guò)程是頗具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N新型輔助提取技術(shù)［6,7］。該技術(shù)具有選擇性高、提取時(shí)間短、易揮發(fā)性成分的提取率高以及不需要特殊的分離步驟等優(yōu)點(diǎn)。微波是頻率介于300MHz和300GHz之間的電磁波，可促使細(xì)胞內(nèi)的介質(zhì)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷，加劇熱運(yùn)動(dòng)，尤其是水分子，吸收微波能量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜沖破，形成孔洞和裂紋，使胞外的溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶出胞內(nèi)有效成分。其穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高，操作簡(jiǎn)便、安全、快速、節(jié)能。潘學(xué)軍等研究了微波輔助提取甘草酸的條件⑻，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微波提取4?5min,乙醇含量為50砰60%，氨水含量為1%?2%,液固比為10：1(mL?g-1)時(shí)，甘草酸的回收率與熱回流法、索氏(Soxhlet)提取法、室溫提取法等傳統(tǒng)提取方法相當(dāng)，但MAE比傳統(tǒng)方法更節(jié)約時(shí)間和溶劑，效率更高。超臨界流體提取法(supercriticalfluidextraction,SFE)原理是通過(guò)調(diào)節(jié)壓力和溫度，使物質(zhì)的氣相和液相消失，形成超臨界流體，溶解力與液體相似，但擴(kuò)散系數(shù)接近氣體，因此，可對(duì)中草藥中的成分進(jìn)行選擇性提取，提取的效率較高，提取液的雜質(zhì)少，提取時(shí)間較短。通常使用的超臨界流體為CO2，其臨界溫度為31106°C，不需要加熱就能將溶質(zhì)和溶劑分開(kāi)，無(wú)毒、高效、價(jià)廉，并具有滅菌功能。李巧玲等卬］研究了超臨界流體技術(shù)萃取甘草酸的各種因素，并與冷浸法、熱提法、超聲波法提取甘草酸作了比較研究，結(jié)果表明SFE法的萃取率高于上述3種方法，而萃取周期大大縮短，并且節(jié)省提取溶劑;付玉杰等［10］通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、壓力、CO2流速以及夾帶劑與甘草粉末的液固比研究了甘草酸水解產(chǎn)物甘草次酸的超臨界CO2提取的工藝。2甘草酸測(cè)定的方法2.1傳統(tǒng)測(cè)定方法傳統(tǒng)測(cè)定甘草皂苷含量的方法是根據(jù)甘草酸遇酸沉淀或酸堿反應(yīng)的理化性質(zhì)采取重量法或滴定法測(cè)定，或根據(jù)其顏色反應(yīng)采取比色的方法測(cè)定，以及根據(jù)其紫外吸收特性采用紫外分光光度法測(cè)定。重量法是將甘草酸提取液進(jìn)行過(guò)濾，加入濃鹽酸或硫酸，使甘草酸沉淀析出，過(guò)濾烘干后精密稱(chēng)定，即得到樣品中含有的甘草酸重量。我國(guó)1977年版藥典規(guī)定的甘草測(cè)定方法即采用重量法。滴定法是先用酸性丙酮浸出甘草粉末中的甘草酸，然后加入氨水，生成甘草酸銨沉淀，加水溶解后，加入已中和過(guò)的甲醛溶液，用氫氧化鈉進(jìn)行滴定。比色法則一般采用亞甲蘭比色法、香草醛2硫酸比色法或Huang試劑顯色等比色法，樣品甘草酸含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出。劉巖［11］等研究發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇等溶劑對(duì)顯色有干擾，需要先將溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行比色，可提高靈檢測(cè)的敏度。由于甘草酸的40%?60%乙醇溶液在252nm有吸收峰，可通過(guò)測(cè)定甘草樣品提取液的紫外吸光度來(lái)確定甘草酸的含量。一般可先用薄層色譜的方法先將甘草酸在薄層板上分離出來(lái)，再用乙醇溶液洗脫定容后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定250nm左右的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出甘草酸的含量。2.2薄層掃描法(TLC)該方法原理與比色法或分光光度法有類(lèi)似之處，通過(guò)測(cè)定薄層掃描儀的單色光透過(guò)薄層板上的組分斑點(diǎn)的透光度或反光度，來(lái)定量測(cè)定樣品中組分的含量。由于采用了薄層色譜與微型計(jì)算機(jī)掃描相結(jié)合的技術(shù)，因此可同時(shí)對(duì)大量的樣品進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單、快速，靈敏度好，精密度較高。袁珂等［12］采用薄層掃描法測(cè)定了復(fù)方冬凌草含片中甘草酸的含量，不用顯色劑在紫外燈下定位，操作簡(jiǎn)便。張繼等［13］采用雙波長(zhǎng)(入s=425nm,入r=700nm)反射鋸齒掃描法測(cè)定了烏拉爾甘草中甘草酸的含量，展開(kāi)劑為醋酸乙酯2甲酸2冰醋酸2水(30:2:2:4),10%硫酸乙醇噴霧,110°。條件下顯色掃描。研究表明TLC測(cè)定甘草酸的含量重復(fù)性好，但薄層板的厚度、均勻度、顯色的時(shí)間、顯色的溫度等對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，需要掌握嚴(yán)格的技術(shù)條件，才能取得較好的測(cè)定效果。2.3氣相色譜法(GC)一般甘草酸先水解為甘草次酸并酯化后測(cè)定，取一定量溶液注入DMCS的玻璃柱內(nèi)，在290°C操作，氮?dú)鉃檩d體，流速60?80mL?min-1,火焰離子化檢測(cè)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出甘草酸含量［14］。2.4高效液相色譜法(HPLC)與TLC和GC相比，HPLC具有重復(fù)性好、受環(huán)境和操作影響小、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定迅速的特點(diǎn)，成為近年來(lái)中藥有效成分分析的重要方法，在甘草研究中已獲得廣泛應(yīng)用。流動(dòng)相通常為甲醇2水2醋酸或水2乙腈2醋酸等，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,色譜柱為ODSC18,流速110mL?min-1,柱溫30C。梁月琴等密］用HPLC測(cè)定甘草及其制劑中甘草酸含量，發(fā)現(xiàn)此法提取簡(jiǎn)單，測(cè)定迅速，精密度較好。色譜條件：流動(dòng)相甲醇201066mol-L-1醋酸溶液(65：35),pH310，流速1mL?min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)255nm，色譜柱C18(319mmX150mm)，最低檢測(cè)量為01川g，甘草酸的進(jìn)樣量為2144?19156pg。在HPLC中采用最多的為反相液相色譜(RP2HPLC),與正相色譜相比，RP2HPLC操作比較方便。李巧玲等問(wèn)對(duì)3種反相色譜技術(shù)和流動(dòng)相的組成、離子抑制劑濃度、流速等影響因素進(jìn)行了研究，找到了分離效果較佳的反相離子抑制分析甘草酸的條件(流動(dòng)相醋酸2甲醇2水比例為2:73:25，流速015mL-min-1)。2.5毛細(xì)管電泳法(CE)CE的原理是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分之間電淌度或分配行為差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離方法。其特點(diǎn)是樣品用量小、柱效高、速度快、自動(dòng)化程度高，可簡(jiǎn)化樣品前處理并有利于多組分分析，目前已成為藥用植物有效成分分析的主要高效定量分析技術(shù)之一，在甘草酸的測(cè)定中發(fā)展也較快。彭軍等［17止匕較了HPLC、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MECC)測(cè)定甘草制品中甘草酸的含量,認(rèn)為MECC與HPLC分析數(shù)據(jù)接近，但比HPLC分離效率高、溶劑用量少，是一種很有潛力的分析方法。祖元?jiǎng)偟?］采用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定了甘草中甘草酸的含量，其采用的電泳條件為：270A2HT型毛細(xì)管電泳儀，在pH518的磷酸緩沖液中，檢測(cè)波長(zhǎng)為252nm,分離電壓為25kV，進(jìn)樣壓力2167kPa,溫度30°C。3.結(jié)論甘草及甘草制品中有效成分的提取和測(cè)定分析技術(shù)是研究和控制甘草及其制品質(zhì)量的重要技術(shù)手段，不斷提高甘草酸提取、分離、純化和檢測(cè)技術(shù)水平，有利于甘草酸藥品質(zhì)量控制的現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。在甘草酸的提取過(guò)程中要求提取快速、完全，雜質(zhì)較少，目前以氨性醇的提取效果較好，但由于其存在氨氣污染等缺點(diǎn)，在實(shí)際工藝中需要改進(jìn)加以完善;在甘草酸的測(cè)定方法中除本綜述的幾種分析方法外，還有電位滴定法、極譜法、棒狀薄層分析法等，但目前分析測(cè)定方法在向操作簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)、高效、經(jīng)濟(jì)方向發(fā)展，在甘草酸的實(shí)際測(cè)定中主要以液相色譜法為主。參考文獻(xiàn)王照蘭，杜建材，于林清，等.甘草的利用價(jià)值、研究現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題[J].中國(guó)草地，2002,24(1):73.張繼，姚健，丁蘭，等.甘草的利用研究進(jìn)展[J].草原與草坪,2000,89:12.李璘，金亦濤，邱蓉麗.甘草酸類(lèi)藥物的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].抗感染藥學(xué)，2004,1(3):11.谷會(huì)巖，郭興順，楊逢建.國(guó)內(nèi)甘草酸測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,30(4):79.趙茜，李秉滔，劉欣，等.超聲強(qiáng)化甘草酸提取的研究[J].食品科技，2000,:38.ViorL，YangR.Microwave一assistedextractedoforganiccompoundsfromstandardreferencesoilsandsediments[J].AnalChem.,1994,66:1097一1106.RodriguezI,SantamarinaM,BollainMH,eta1.Specia一tionoforganotincompoundsinmarinebiomaterialafterbasicleachinginan一focusedmicrowaveextractoe一quippedwithpressurizedvessels[J].JChromatogr.,1997,774：379一387．潘學(xué)軍，劉會(huì)洲，賈光和，等.從甘草中提取甘草酸不同提取方法的比較[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2001,1(1):102.李巧玲，周明華，陳俊南.超臨界流體萃取在甘草酸分析中的應(yīng)用[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，1998,17(1):37.付玉杰，祖元?jiǎng)?，李春英，?超臨界CO2萃取甘草中甘草次酸的工藝研究[J].中草藥，2003,34(1):31.劉巖，胡漢芳，閻正，等.用比色法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998,18(4):50.袁珂，翟劍波，胡潤(rùn)淮，等.薄層掃描法測(cè)定復(fù)方冬凌草含片中甘草酸的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1998,4(1):2.張繼，楊永利，王萊.雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定烏拉爾甘草中甘草酸的含量[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1998,34(1)