第三章酶和細(xì)胞的固定化

技術(shù)及其應(yīng)用酶的概述具有高效和專一催化功能的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸兩類。酶調(diào)控著新陳代謝，是生命活動的基礎(chǔ)。反應(yīng)條件溫和催化效率特別高具有高度的專一性（絕對專一性、相對專一性、立體異構(gòu)專一性）酶作為一種生物催化劑，因其催化作用具有高度專一性、催化條件溫和、無污染等特點，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥和精細(xì)化工等行業(yè)。但在使用過程中，人們也注意到酶的一些不足之處，如酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用，并且反應(yīng)后混入產(chǎn)品，純化困難，使其難以在工業(yè)中更為廣泛的應(yīng)用。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，人們模仿人體酶的作用方式，通過固定化技術(shù)對酶加以固定改造，來克服游離酶在使用過程中的一些缺陷。酶的固定化固定化酶是一種在空間運動上受到完全約束或局部約束且仍具有活性的酶。近代工業(yè)化利用始于1969年固定化氨基?；傅膽?yīng)用。利用固定化技術(shù)，解決了酶應(yīng)用過程中的很多問題，為酶的應(yīng)用開辟了新的前景。如可使所使用的酶、細(xì)胞能反復(fù)使用，使產(chǎn)物分離提取容易，并在生產(chǎn)工藝上可以實現(xiàn)連續(xù)化和自動化，故在20世紀(jì)70年代后得到迅速發(fā)展。其新的功能和新的應(yīng)用正在迅速不斷地擴展，是一項研究領(lǐng)域?qū)拸V、應(yīng)用前景極為引人矚目的新研究領(lǐng)域和新技術(shù)。酶固定化的優(yōu)點同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟?？砷L期使用，并可預(yù)測衰變的速度。提供了研究酶動力學(xué)的良好模型可以提高生物反應(yīng)器的選擇范圍多數(shù)情況下，熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性提高。載體和固定化方法固定化酶性質(zhì)目標(biāo)要求、反應(yīng)器特點、各部分特性載體選擇的原則必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。酶的催化反應(yīng)取決于酶本身蛋白質(zhì)分子所特有的高級結(jié)構(gòu)和活性中心，為了不損害酶的催化活性及專一性，酶在固定化狀態(tài)下發(fā)揮催化作用時，既需要保證其高級結(jié)構(gòu)，又要使構(gòu)成活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化。這就要求酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位由于酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)是憑借疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等較弱的鍵維持的，所以固定化時應(yīng)采取盡可能溫和的條件，避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級結(jié)構(gòu)破壞的條件，如高溫、強酸、強堿、有機溶劑等處理。酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復(fù)使用。固定化應(yīng)有利于自動化、機械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機械強度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。在應(yīng)用過程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。固定化酶的成本適中。工業(yè)生產(chǎn)必須要考慮到固定化成本，要求固定化酶應(yīng)是廉價的，以利于工業(yè)使用。常用固定化材料無機材料有機材料生物材料碳酸鈣聚乙烯醇纖維素氧化鋁聚乙烯葡聚糖活性炭尼龍海藻酸鹽新型固定化載體納米材料磁性微球等離子體材料固定化方法酶的固定化方法主要可分為五類：吸附法、包埋法、微囊法、共價鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。吸附法和共價鍵結(jié)合法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。吸附法吸附法是固定化方法中最簡單的方法。吸附法（adsorption）是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子交換吸附法。物理吸附法物理吸附法(physicaladsorption)是通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用過此法進行固定化。物理吸附法常用的有機載體如纖維素、膠原、淀粉及面筋等；無機載體如活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。離子交換吸附法離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、β-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。如最早應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的氨基?；福褪鞘褂枚嗵穷愱庪x子交換劑二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝膠固定化的。此外，DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。

吸附法固定酶的優(yōu)缺點？載體中酶蛋白的解吸脫落和非專一性吸附是比較嚴(yán)重的問題。蛋白質(zhì)在載體上的吸附和解吸與下列因素有關(guān)：

pH、鹽、酶濃度、溫度、吸附速度、載體共價結(jié)合法共價鍵結(jié)合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。半胱氨酸殘基的巰基。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。組氨酸殘基的咪唑基。色氨酸殘基的吲哚基。苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。其中最普遍的共價鍵結(jié)合基團是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來和酶共價偶聯(lián)的載體的功能基團有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法，但必須注意，參加共價結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團，如若共價結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團，會導(dǎo)致酶的活力損失。載體活化方法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團偶聯(lián)成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團的載體都可用此法活化。溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。由于該法可在非常緩和的條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應(yīng)，近年來已成為普遍使用的固定化方法。主要優(yōu)缺點優(yōu)點：酶和載體之間的連接很牢固，不會發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性較好。缺點:載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較劇烈。若共價結(jié)合包含酶活性中心有關(guān)的基團，會導(dǎo)致酶的活力損失。包埋法它是一種用物理方法將酶包埋在高聚物內(nèi)，反應(yīng)條件溫和．并且不改變酶結(jié)構(gòu)的固定化方法。材料有聚丙烯酰胺、三醋酸纖維、淀粉、硅膠、血纖維和膠原等。微囊法有時候被稱為包埋法的一種酶或細(xì)胞是游離的，但限制在一定的空間。懸浮液被包裹在膜內(nèi)，使酶存于類似細(xì)胞的環(huán)境中，阻止了酶的脫落。小分子底物則能迅速通過膜與酶作用，產(chǎn)物擴散出來。常用尼龍膜、醋酸纖維素等。需要控制反應(yīng)速率和反應(yīng)器參數(shù)以適應(yīng)微囊法的應(yīng)用。交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶活力的提高。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。常加入白蛋白或明膠作空間間隔；與其它固定方法聯(lián)用。酶的穩(wěn)定性固定化酶對熱、各種變性劑的耐受性增強，穩(wěn)定性提高。

固定化酶穩(wěn)定性提高的原因：酶分子與載體多點連接，可防止酶變形；酶活力的緩慢釋放；抑制酶的自降解；固定化酶的性質(zhì)最適溫度固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。由于固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高。影響固定化酶最適pH因素主要有兩個：載體的帶電性質(zhì)；負(fù)電的載體固定化酶，最適pH比游離酶高；正電的載體固定化酶，最適pH比游離酶低；電中性的載體固定化酶，最適pH一般不改變。酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物性質(zhì)。產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的最適pH比游離酶高；產(chǎn)物為堿性時，固定化酶的最適pH比游離酶低；產(chǎn)物為中性時，最適pH一般不改變。固定化酶的活性固定化酶的活性較水溶性酶有所下降原因：酶分子空間結(jié)構(gòu)的變化，影響活性中心氨基酸。空間位阻影響底物與酶的定位作用。外擴散和內(nèi)擴散阻力影響底物與酶的接觸。個別固定化酶活力增強可能是酶得到化學(xué)修飾或穩(wěn)定性增加。共價結(jié)合法由于反應(yīng)劇烈，最容易改變酶蛋白構(gòu)象，對酶活性影響很大。載體材料可通過影響反應(yīng)組分的分配效果而改變固定化酶的反應(yīng)活性。提高攪拌速度、加快流體流動可以改善外擴散限制。細(xì)胞固定化將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。一般采用對細(xì)胞傷害較小的吸附法和包埋法。特點：密度大、可增殖。提高生產(chǎn)能力，縮短發(fā)酵周期。穩(wěn)定性高，可反復(fù)利用。有利于產(chǎn)品分離純化。吸附法固定細(xì)胞采用各種固體吸附劑，將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法。吸附法是細(xì)胞固定化中使用最廣泛的方法。優(yōu)點：操作簡便、成本低、可再生、固定化載體選擇范圍廣。缺點：穩(wěn)定性差包埋法固定細(xì)胞應(yīng)用廣泛，采用海藻酸鈣等固定活細(xì)胞、增殖細(xì)胞效果好。適用于底物和產(chǎn)物分子量較小。固定化細(xì)胞分類固定化細(xì)胞分類：微生物細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞。活細(xì)胞：固定化靜止細(xì)胞不生長，休眠