院系：生化環(huán)院任課老師：吳雨龍任課班級：09食品、行09食品食品專業(yè)食品毒理學(xué)實驗通過本次實驗,學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細胞(PCE)微核的測定方法，了解環(huán)磷酰胺對骨髓細胞染色體的損傷作用。實驗五小鼠骨髓細胞微核試驗實驗?zāi)康?.1.實驗原理2.

微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測方法。微核是指存在于細胞中主核之外的一種顆粒，大小相當(dāng)于細胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細胞核一致，在間期細胞中可以出現(xiàn)一個或多個。一般認為微核是細胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細胞有絲分裂后期滯留在細胞核外的遺傳物質(zhì)。實驗動物：實驗材料3.體重18-22g小鼠，雌雄對半。實驗器材：手術(shù)剪、晾片架、眼科剪、眼科鑷、顯微鏡、飼養(yǎng)籠等。實驗試劑：甲醇、冰醋酸、吉姆薩染液、小牛血清、生理鹽水、環(huán)磷酰胺。4.實驗步驟1.動物選擇：一般常用的試驗動物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18～20g，7-12周齡。每組小鼠數(shù)量10只，雌雄各半。2.染毒途徑：根據(jù)研究目的或受試化學(xué)毒物性質(zhì)的不同，可分別選用經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應(yīng)盡可能采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。3.染毒次數(shù)及取樣時間：研究證實化學(xué)毒物需在靶器官內(nèi)蓄積至一定的濃度才具有致突變作用。不同化學(xué)毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間也不盡相同。波動范圍可以達到24～72h。這就要一、試驗動物及處理4.實驗步驟求在接觸化學(xué)毒物后設(shè)立不同的采樣時間點?？紤]到以上兩方面的原因，建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染毒一次，連續(xù)4天，第5天取樣。這樣，取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會漏掉。4.劑量選擇：受試化學(xué)毒物的最大劑量除受溶解度大小所限外，應(yīng)達到最大耐受量。一般情況下，應(yīng)設(shè)3～5個或更多劑量組，劑量覆蓋的范圍要達到3個數(shù)量級以上。同時還應(yīng)設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。陽性對照組可用環(huán)磷酰胺(50-100mg/kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射1次或2次。陰性對照組使用等體積的溶劑。4.實驗步驟二、骨髓液的制備和涂片

試驗動物最后一次染毒后，按確定的時間用頸椎脫臼或麻醉的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去股骨兩端，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在動物處死后，迅速用手術(shù)剪將其兩腿股骨取下，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去股骨兩端，用帶針頭的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖人離心管，然后用吸管吹打骨髓團塊使其均勻，以1000r／min離心10min，棄去多余的上清液，留下約0.5ml4.實驗步驟五、觀察計數(shù)

先在低倍鏡下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計數(shù)，PCE細胞呈灰藍色，正染紅細胞(NCE)呈橘黃色。細胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍紫色。一個細胞內(nèi)可出現(xiàn)一個或多個微核。計數(shù)1000個PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計數(shù)20