細(xì)胞培養(yǎng)Cellculture模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。

體外培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念原代培養(yǎng)

動(dòng)物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長，在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)

常用的名稱組織來源

Hep-2HeLaA549Vero

HEKCHO

…人喉癌人子宮頸癌人肺癌非洲綠猴腎人胚腎中國地鼠卵巢細(xì)胞

…代表性的細(xì)胞命名法

細(xì)胞名稱命名意義

HeLa為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO中國地鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamsterOvary）宮-743宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3美國國立衛(wèi)生研究所（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。美國已有美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細(xì)胞庫（HGMR）、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫（CAR）等，其中ATCC不僅是美國也世界最大的細(xì)胞庫。ATCC也是世界衛(wèi)生組織WHO的國際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心。ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個(gè)已經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系，其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細(xì)胞系和來自不同物種的近75個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。ATCC接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存，同時(shí)也向世界各國的研究者或?qū)嶒?yàn)室免費(fèi)提供研究用細(xì)胞（做盈利性研究時(shí)收費(fèi)）。

每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性細(xì)胞培養(yǎng)方式

群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克?。╟lone）。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件無污染環(huán)境:生物安全柜，超凈工作臺(tái)基質(zhì):玻璃，塑料…營養(yǎng)需要:氨基酸，碳水化合物，無機(jī)鹽，緩沖系統(tǒng)，維生素…(商業(yè)化合成培養(yǎng)基)

pH:7.2-7.4溫度:37℃，細(xì)胞培養(yǎng)箱氣體環(huán)境O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

二級(jí)生物安全柜CO2培養(yǎng)箱

CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h或者紫外殺菌)。③箱內(nèi)置4-6L蒸餾水，加入100ml飽和硫酸銅溶液，以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)，并抑制真菌污染。

培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板酶標(biāo)儀微孔板震蕩器濾器實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備

常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌抗生素的使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升培養(yǎng)基的配制

RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（無菌原則）無菌工作臺(tái)用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上。清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用75%酒精擦拭。操作時(shí)注意無菌臺(tái)內(nèi)空間層次。整個(gè)操作過程盡量在無菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，嚴(yán)格注意無菌操作。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長細(xì)胞傳代此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。貼壁生長細(xì)胞傳代方法吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測）。加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。吸取1/3細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞復(fù)蘇方法從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。低速離心10分鐘。去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)儀Counter血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber

中細(xì)刻9

個(gè)1

mm2大正方形，其中4

個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16

個(gè)小格，深度均為0.1

mm。當(dāng)chamber

上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1

mm2

x

0.1

mm=1.0

x

10-4

ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml

中之細(xì)胞數(shù)目。

培養(yǎng)細(xì)胞活力測定臺(tái)盼藍(lán)法，trypan

blue，

利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力細(xì)胞計(jì)數(shù)取10ul

細(xì)胞懸液，稀釋于990ulPBS，取10ul自血球計(jì)數(shù)盤chamber

上方凹槽加入(已蓋上蓋玻片），于顯微鏡下計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)，最后乘以104

，即為每ml

中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)，稀釋倍數(shù)為100，故而細(xì)胞濃度為4大方格總數(shù)/

4x100

x

104

轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的區(qū)別轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)染的定義是“將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能”。通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染。常特指將質(zhì)?；蛞运鼈?yōu)檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。一般來說，在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β-半乳糖苷酶等來幫助檢測。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過選擇性標(biāo)記篩選，如抗生素篩選APH（新霉素抗性基因），HPH（潮霉素），TK（胸苷激酶）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。常用轉(zhuǎn)染技術(shù)見附表影響轉(zhuǎn)染效率的因素細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔円欢ǖ募?xì)胞密度推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能血清血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。DNA質(zhì)量一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2xCsCl梯度離心以上的純度效果，使DNA質(zhì)量得到保證。對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染技術(shù)本次實(shí)驗(yàn)背景腺病毒系統(tǒng)為MicrobixBiosyst