T/CSMAXXXX－2018高良姜種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高良姜（AlpiniaofficinarumHance）種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于高良姜種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。高良姜AlpiniaofficinarumHance為姜科（

Zingiberaceae）山姜屬（AlpiniaRoxb.）多年生草本植物，根莖供藥用，具溫中散寒、止痛消食功能，是“十大南藥”之一。為《中國(guó)藥典（2015）》收載的常用藥材。高良姜果實(shí)AlpiniaofficinarumHancefruits高良姜果球形，直徑約1cm，熟時(shí)紅色。高良姜種子AlpiniaofficinarumHanceseeds高良姜的繁殖材料為完整種子，貯藏習(xí)性判斷為頑拗性種子。種子不規(guī)則扁圓形，表面灰褐色，略有鈍棱。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過(guò)前處理的高良姜種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收7月至9月，當(dāng)果皮轉(zhuǎn)為紅褐色時(shí)，挑選無(wú)病蟲害、無(wú)破損、粒大、成熟的果實(shí)采收，去除果肉，反復(fù)清洗種子。種子選擇挑選飽滿、大小一致、無(wú)病蟲害的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)3個(gè)月）。種子前處理生活力檢測(cè)參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測(cè)定高良姜種子生活力。待測(cè)種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子20粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將胚埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中12h后觀察結(jié)果。生活力計(jì)算在光下用放大鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無(wú)活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的高良姜種子生活力應(yīng)≥70%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹高良姜種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為50000:1，室溫條件下干燥處理40~50h，在干燥過(guò)程可定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由20%~30%降至12%~14%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量高良姜種子保存量不少于360粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式高良姜種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的1mL凍存管（每管30粒種子）置于裝載液（LS）中并于25℃處理種子25min，再用玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）冰浴處理種子30min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出2個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min，而后用洗滌液（DS）浸泡20min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測(cè)取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥70%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的高良姜種子，播種到帶有無(wú)菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度28℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)。高良姜種子出芽周期大概10~20d。附錄[1]BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.1g，溶解于煮沸過(guò)的100mL純水中，然后用濾紙去殘?jiān)?。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，此液長(zhǎng)期貯存于棕色瓶中。1.5%BTB瓊脂凝膠：稱量0.1%BTB溶液40mL置于燒杯中，稱取0.5g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。[2]裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7g，稱量甘油11.9mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8，并定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后，定容至100mL，高溫高壓滅