下丘腦背內(nèi)側(cè)核中不同類(lèi)型神經(jīng)元對(duì)焦慮的影響,人體生理學(xué)論文摘要：下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DorsomedialHypothalamicNucleus,DMH)是自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,同時(shí)與調(diào)控焦慮情緒的邊緣系統(tǒng)存在廣泛聯(lián)絡(luò)。然而,DMH調(diào)控焦慮等負(fù)性情緒的細(xì)胞機(jī)制當(dāng)前尚不明確。該文應(yīng)用光遺傳技術(shù)特異性調(diào)控小鼠的谷氨酸能神經(jīng)元和-氨基丁酸能神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),興奮DMH的谷氨酸能和-氨基丁酸能神經(jīng)元均能顯著誘發(fā)焦慮樣行為和心率上升,抑制兩種神經(jīng)元均能抑制焦慮樣行為并降低心率。該研究證實(shí)了DMH特定類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)焦慮的雙向調(diào)控作用,并有望為神經(jīng)精神疾病的臨床干涉提供新的調(diào)控靶點(diǎn)。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：光遺傳學(xué);下丘腦背內(nèi)側(cè)核;焦慮;心率;Abstract：Dorsomedialhypothalamicnucleus(DMH)isanimportantcomponentofautonomicnervoussystem,whichhasextensiveconnectionswithlimbicsystem.DMHmayparticipatesintheregulationofnegativeemotions,suchasanxietyandfear.However,thecellularmechanismsarestillunknown.Inthisstudy,elevatedplusmazeandopenfiledtestswereperformed,andabidirectionaleffectofoptogeneticmodulationonbehaviorswasfound.ActivatingtheDMHglutamatergicorgamma-aminobutyricacid(GABAergic)neuronsleadingtotheanxiety-likebehaviorandincreasingofheartrate,whileopticalinhibitionsignificantlysuppressedtheanxiety-likebehavioranddecreasedheartrate.Thesefindingsmayprovidenewtargetsforclinicaltherapyforneuropsychiatricdisorders.Keyword：optogenetics;dorsomedialhypothalamicnucleus(DMH);anxiety;heartrate;1、引言隨著當(dāng)代生活節(jié)拍不斷加快,人們工作和學(xué)習(xí)壓力逐步增大,極易誘發(fā)情緒異常。焦慮是最常見(jiàn)的負(fù)性情緒之一,對(duì)人們身心健康有著較大的危害。長(zhǎng)時(shí)間焦慮易導(dǎo)致失眠[1],誘發(fā)產(chǎn)生躁狂、抑郁、藥物成癮、精神分裂等精神疾病[2,3],并增加罹患心臟病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[4,5]。因而,解析產(chǎn)生負(fù)性情緒背后的神經(jīng)回路機(jī)制,揭示焦慮情緒的調(diào)控形式,對(duì)于改善人情緒異常狀況,十分是長(zhǎng)時(shí)間受焦慮情緒困擾的人群意義重大[6,7]。焦慮樣行為通常被以為與腹側(cè)海馬(VentralHippocampus)、杏仁核(Amygdala)等腦區(qū)密切相關(guān)[8]。海馬下托(Subiculum)作為海馬的一個(gè)重要出口,是介導(dǎo)大腦皮層(CerebralCortex)與皮層下腦區(qū)的重要核團(tuán)。華而不實(shí),海馬下托的-氨基丁酸(GABA)能系統(tǒng)和谷氨酸系統(tǒng)對(duì)于調(diào)控焦慮情緒起到重要的作用[9,10]。杏仁核由多個(gè)亞區(qū)組成,華而不實(shí)的基底外側(cè)杏仁核和杏仁核在編碼焦慮樣行為中的作用尤為顯著[11,12]。首先,外側(cè)杏仁核接收來(lái)自丘腦(Thalamus)和前額葉皮層(PrefrontalCortex,PFC)的感覺(jué)信息傳入;其次,信息流途經(jīng)基底外側(cè)杏仁核處理后,再經(jīng)過(guò)杏仁核基核并做進(jìn)一步處理;最后,信息流到達(dá)外側(cè)杏仁核,并在華而不實(shí)進(jìn)行最終的處理編碼[13,14]。研究顯示,下丘腦也介入了對(duì)焦慮和恐懼等負(fù)性情緒的調(diào)節(jié)。下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DorsomedialHypothalamicNucleus,DMH)、下丘腦的腹側(cè)內(nèi)側(cè)核團(tuán)(VentromedialHypothalamus,VMH)、下丘腦前端乳頭體(PremamillaryRegionoftheHypothalamus)、下丘腦前端核團(tuán)(AnteriorHypothalamicNucleus)、下丘腦外側(cè)核團(tuán)(LateralHypothalamus)等的GABA能系統(tǒng)介入了恐懼的調(diào)控作用[15,16]。華而不實(shí),前額葉皮層和DMH的GABA能回路調(diào)節(jié)場(chǎng)景相關(guān)的本能學(xué)習(xí)與本能情緒[17]。前額葉皮層與內(nèi)側(cè)下丘腦存在廣泛連接,且通過(guò)NMDA和AMPA/Kainate谷氨酸受體與內(nèi)側(cè)下丘腦中GABA受體的互相作用調(diào)節(jié)防御行為和先天性焦慮誘導(dǎo)的回避傷害行為[18]。人們通過(guò)刺激DMH、VMH的背內(nèi)側(cè)區(qū)以及背側(cè)導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(MedialPericatheterGray)發(fā)現(xiàn),這些核團(tuán)與定向和非定向逃逸行為存在相關(guān)性[19]。除此之外,VMH和DMH的GABA受體阻滯引起焦慮樣的行為,并且產(chǎn)生先天性焦慮誘導(dǎo)的回避傷害行為[20,21]。需要指出的是,DMH作為自主神經(jīng)系統(tǒng)的較高級(jí)中樞,與上述焦慮情緒相關(guān)的腦區(qū)存在廣泛的投射關(guān)系。DMH與外側(cè)杏仁核、內(nèi)側(cè)杏仁核、導(dǎo)管周?chē)屹|(zhì)、終紋床核(BedNucleusofStriaTerminalis)以及迷走神經(jīng)背復(fù)合體(DorsalVagalComplex)等多種焦慮相關(guān)腦區(qū)存在投射關(guān)系,并對(duì)其具有靶向調(diào)節(jié)作用[22]。越來(lái)越多研究證實(shí),DMH在調(diào)節(jié)著體溫、攝食、飲水、血糖和心率等重要生理功能的同時(shí)[23],也介入對(duì)焦慮等負(fù)性情緒的調(diào)節(jié)。例如,電刺激DMH和VMH會(huì)導(dǎo)致防御性行為的產(chǎn)生,以及血壓上升、皮膚及小腸血管收縮、心率加速等交感神經(jīng)性反響[24]。DMH的Y神經(jīng)肽影響內(nèi)臟對(duì)胰島素的敏感性,進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生對(duì)焦慮的敏感樣行為[23]。刺激DMH谷氨酸能中間神經(jīng)元引起的心率失常[25]。DMH的GABA能神經(jīng)元損傷引起的焦慮樣行為[17]。DMH的5-羥色胺1A受體介導(dǎo)T迷宮升高時(shí)的恐慌相關(guān)反響[26]。然而,DMH調(diào)控焦慮等負(fù)性情緒的細(xì)胞機(jī)制當(dāng)前尚不明確。為此,本研究采用光遺傳技術(shù)來(lái)解析DMH中不同類(lèi)型神經(jīng)元對(duì)焦慮的影響。借助高架十字迷宮(ElevatedPlus-MazeTest,EPM)和曠場(chǎng)(OpenFieldTest,OFT)行為學(xué)范式對(duì)小鼠的焦慮情緒的變化進(jìn)行評(píng)估,并同時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的心率變化。我們?cè)谛∈驞MH中表示出了不同類(lèi)型的標(biāo)記蛋白(AAV9-CaMKII-ChR2-mcherry、AAV9-CaMKII-NpHR-mcherry、AAV9-DIO-ChR2-mcherry和AAV9-DIO-NpHR-mcherry),利用光纖植入體特異性激活或抑制DMH特定類(lèi)型的神經(jīng)元,實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠焦慮情緒的雙向調(diào)節(jié)。本研究有望為臨床干涉焦慮癥提供新的靶點(diǎn)和理論根據(jù)。2、實(shí)驗(yàn)2.1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備2.1.1、溶液的配制磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution,PBS)采用PBS緩沖液干粉(品牌Solarbio),pH為7.2～7.4。多聚甲醛溶液采用多聚甲醛粉末(MOLBASE),根據(jù)4%的質(zhì)量與體積比,在60℃恒溫條件下緩慢溶解于PBS緩沖液中配制而成。蔗糖溶液采用蔗糖粉末(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司),根據(jù)30%的質(zhì)量與體積比,在常溫條件下溶解于PBS緩沖液中配制而成。水合氯醛麻醉溶液采用水合氯醛粉末(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),根據(jù)10%的質(zhì)量與體積比,在常溫條件下溶解于生理鹽水(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中配制而成,并保存于棕色玻璃瓶中。上述溶液均保存于4℃冰箱中。2.1.2、光纖植入體的制備光纖植入體采用市售的直徑200m光纖(紐頓控股有限公司)和與之匹配的陶瓷插芯(紐頓控股有限公司)制作而成。首先,剪取適當(dāng)長(zhǎng)度的光纖,用光纖剝線鉗(紐頓控股有限公司)剝?nèi)ヒ欢说谋Ｐl(wèi)皮層(1cm左右),用鎢鋼刀手工環(huán)切端口處,在光學(xué)顯微鏡下檢查切口,反復(fù)環(huán)切直到平整為止。然后,光纖去皮端穿過(guò)陶瓷插芯,在光纖的光出射端涂抹環(huán)氧樹(shù)脂膠固定。用細(xì)砂紙輕輕打磨光纖的激光入口端,顯微鏡下檢查光纖與陶瓷插芯耦合整潔即可。最后,根據(jù)腦區(qū)的深度環(huán)切光纖頭的光出射端,用市售商用的光強(qiáng)計(jì)(SanwaLP1手持式激光功率計(jì))測(cè)試光纖的透光率,透光率到達(dá)60%以上的視為合格。2.2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用的小鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)的專門(mén)飼養(yǎng)間內(nèi),給予12h-12h交替與晝夜同步的光照條件。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。華而不實(shí),C57小鼠(8～12周齡、雄性,體重20g左右)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;GAD-cre轉(zhuǎn)基因小鼠(8～12周齡、雄性,體重20g左右)是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院培育出的轉(zhuǎn)基因品系,經(jīng)基因鑒定合格。2.3、手術(shù)實(shí)驗(yàn)2.3.1、病毒的注射首先,腹腔麻醉小鼠(每10g小鼠注射0.04mL10%的水合氯醛麻醉溶液),待小鼠完全麻醉后,用彎頭剪刀(上海金鐘醫(yī)療器械有限公司)剪去頭毛,露出頭皮,固定在立體定位儀(瑞沃德)上,用碘伏消毒后,剪開(kāi)始皮并用手術(shù)鑷(FST,5號(hào))取少許棉花擦拭頭皮,直到能夠清楚明晰看到顱骨骨縫為止。其次,以前囟(Bregma點(diǎn))和后囟(Lambda點(diǎn))為參考試點(diǎn),反復(fù)調(diào)節(jié),使得小鼠腦在前后、左右均處于水平位置。最后,調(diào)節(jié)立體定位儀,用微量注射器的針頭確定注射目的腦區(qū),接著用顱骨鉆打孔(瑞沃德微型手持式顱鉆),緊接著用注射泵(瑞沃德微量注射泵Legato130)汲取病毒(汲取速率為100nL/s),預(yù)注射50nL,確定注射針未堵塞(看針頭處有小液泡)后,緩慢地將針頭旋轉(zhuǎn)下降至目的腦區(qū)并開(kāi)場(chǎng)注射(注射速率100nL/min)。隨后,停針與注射一樣的時(shí)間,緩慢地將注射針頭旋出腦組織,并將小鼠傷口縫合消毒。本實(shí)驗(yàn)對(duì)C57小鼠注射AAV9-CaMKII-ChR2-mcherry病毒,對(duì)GAD-cre轉(zhuǎn)基因小鼠注射AAV9-DIO-ChR2-mcherry病毒;作為對(duì)照組,對(duì)C57小鼠注射AAV9-CaMKII-NpHR-mcherry病毒,對(duì)GAD-cre轉(zhuǎn)基因小鼠注射AAV9-DIO-NpHR-mcherry病毒。注射位點(diǎn)均為DMH(AP:-1.6,ML:-0.35,DV:-5.0),注射劑量均為300nL。華而不實(shí),以小鼠腦前囟(Bregma點(diǎn))為坐標(biāo)原點(diǎn)、后囟(Lambda點(diǎn))為(0,0,4.24)參考試點(diǎn)建立空間直角坐標(biāo)系。因而,AP代表小鼠腦的頭尾段坐標(biāo);ML代表小鼠腦偏離中線的坐標(biāo);DV代表小鼠腦垂直坐標(biāo)。2.3.2、埋植光纖植入體首先,重復(fù)2.3.1手術(shù)實(shí)驗(yàn)至擦拭清楚明晰看到顱骨骨縫。在顱骨上選取適當(dāng)?shù)奈恢?顱鉆打孔后擰入顱釘(4顆)。其次,以前囟(Bregma點(diǎn))和后囟(Lambda點(diǎn))為參考試點(diǎn),反復(fù)調(diào)節(jié),使得小鼠腦在前后、左右均處于水平位置。最后,調(diào)節(jié)立體定位儀,并用光纖尖端確定注射目的腦區(qū),用顱鉆打孔后,再次調(diào)節(jié)立體定位儀,緩慢地將光纖頭旋轉(zhuǎn)下降至目的腦區(qū),用牙科水泥封裝光纖植入體,待牙科水泥凝固后,先松開(kāi)定位儀上的光纖植入體,再松開(kāi)固定小鼠的耳桿。本實(shí)驗(yàn)中,所有實(shí)驗(yàn)小鼠光纖埋置時(shí)間為病毒注射后四周,光纖埋置的位點(diǎn)均為DMH(AP:-1.6,ML:-0.35,DV:-4.8)。為了使結(jié)果具有較好的光刺激效果,光纖的埋植位點(diǎn)要比病毒注射位點(diǎn)淺0.2mm。2.3.3、灌流及腦組織的固定經(jīng)過(guò)首先,將完全麻醉后的小鼠腹部朝上固定在灌流臺(tái)上,用手術(shù)剪刀剪開(kāi)小鼠的腹腔和胸腔,在左心室心尖處插入灌流針頭,用止血鉗固定,剪破右心房,先后灌注PBS溶液(20mL/min)和PFA固定溶液(18mL/min)。其次,完成灌流后,將腦組織取出并浸泡在4%的PFA固定液中固定,隨后更換為30%的蔗糖溶液。最后,當(dāng)觀察到小鼠腦沉到蔗糖溶液的底部時(shí),取出包埋并存放在-20℃冰箱中。2.4、切片與免疫組化分析首先,將包埋后的鼠腦固定,用冰凍切片機(jī)切片(LeicaCM1950冰凍切片機(jī))。華而不實(shí),切片厚度為30m。然后,收集目的腦區(qū)腦片,將其浸泡于NaN3-PBS溶液(NaN3,0.1%),洗滌(PBS溶液)并貼腦片,滴加4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染料,加蓋蓋玻片后封片。最后,玻片掃描(Olympus全切片掃描儀)拍照,觀察目的腦區(qū)熒光標(biāo)記情況,進(jìn)而確定病毒注射和光纖埋植位點(diǎn)。2.5、行為學(xué)和心率測(cè)試實(shí)驗(yàn)2.5.1、行為學(xué)測(cè)試裝置本研究采用光遺傳調(diào)控技術(shù),結(jié)合高架十字迷宮(EPM)和曠場(chǎng)(OFT)來(lái)研究DMH與焦慮情緒之間的關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)所用EPM和OFT裝置材質(zhì)均為白色無(wú)味的塑料材質(zhì),均參照國(guó)際上的通用規(guī)格設(shè)計(jì)(EPM:高度為60cm,臂長(zhǎng)為56cm,臂寬為6cm;OFT:底邊邊長(zhǎng)為50cm,四壁高度為60cm)。2.5.2、光遺傳刺激參數(shù)EPM、OFT和心率測(cè)試實(shí)驗(yàn)的光遺傳刺激參數(shù)均一樣。波長(zhǎng),473nm藍(lán)光(激活實(shí)驗(yàn))、589nm黃光(抑制實(shí)驗(yàn));刺激頻率,20Hz(C57小鼠)、40Hz(GAD-cre轉(zhuǎn)基因小鼠);延遲,0.0ns;幅度,5.0峰峰值電壓;直流分量,0mv;斜率,正;脈沖寬度,5.0ms;觸發(fā)延遲,0.0ns。調(diào)節(jié)激光器的輸出,當(dāng)光纖末端功率為10mW/mm2左右時(shí)為合格刺激光源。2.5.3、高架十字迷宮(EPM)測(cè)試實(shí)驗(yàn)開(kāi)場(chǎng)測(cè)試時(shí),將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入高架十字迷宮區(qū),頭朝開(kāi)放臂方向。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)試時(shí)的放置位點(diǎn)和頭部朝向均保持一致。打開(kāi)攝像機(jī),以5min無(wú)光刺激、5min光刺激、5min無(wú)光刺激的形式拍攝,記錄動(dòng)物在開(kāi)放臂、閉合臂和區(qū)的行為。實(shí)驗(yàn)全經(jīng)過(guò)中,實(shí)驗(yàn)人員距離高架十字迷宮保持1m的距離。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為記錄結(jié)束之后放回原鼠籠內(nèi),同時(shí)清理十字迷宮,接著用5%的醋酸水溶液或20%的酒精擦拭迷宮內(nèi)部,消除上一只動(dòng)物殘留氣味對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。2.5.4、曠場(chǎng)(OFT)測(cè)試實(shí)驗(yàn)開(kāi)場(chǎng)測(cè)試時(shí),將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入曠場(chǎng)區(qū),每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)試時(shí)的放置位點(diǎn)和頭部朝向均保持一致。打開(kāi)攝像機(jī),以10min無(wú)光刺激、10min光刺激、10min無(wú)光刺激的形式拍攝,記錄動(dòng)物在區(qū)和邊緣區(qū)的行為。實(shí)驗(yàn)全經(jīng)過(guò)中,實(shí)驗(yàn)人員距離曠場(chǎng)裝置保持1m的距離。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物拍攝記錄結(jié)束之后放回原鼠籠內(nèi),同時(shí)清理曠場(chǎng)裝置,接著用5%的醋酸水溶液或20%的酒精擦拭曠場(chǎng)內(nèi)部,消除上一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物殘留的氣味對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。2.5.5、心率測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遭遇焦慮、恐懼等負(fù)性情緒來(lái)襲時(shí),生理信號(hào),如呼吸頻率、心率、血壓以及血氧飽和度等生理信號(hào)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。我們?cè)跍\麻醉(每10g小鼠注射0.02mL10%的水合氯醛麻醉溶液)狀態(tài)下測(cè)試動(dòng)物在接受光刺激前后的心率變化,作為其焦慮情緒變化的一個(gè)補(bǔ)充證據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用脈搏血氧儀(Starrlifescience,MouseOx),在無(wú)創(chuàng)條件對(duì)生理信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和記錄。待小鼠微麻醉后,用脫毛膏對(duì)小鼠頸部進(jìn)行脫毛處理,之后將小鼠放在單獨(dú)的籠具內(nèi),夾上脖圈(生理信號(hào)的輸入裝置),待信號(hào)穩(wěn)定后,開(kāi)場(chǎng)記錄測(cè)量。整個(gè)測(cè)量經(jīng)過(guò)中,保持小鼠的頸部伸展,防止頸部彎曲窒息。每只老鼠測(cè)試5～8個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包含如下階段:60s無(wú)光刺激、30s光刺激、60s無(wú)光刺激。每個(gè)循環(huán)都要待信號(hào)穩(wěn)定后再開(kāi)場(chǎng)測(cè)量,且全經(jīng)過(guò)保持信號(hào)穩(wěn)定。2.6、數(shù)據(jù)分析2.6.1、行為學(xué)數(shù)據(jù)分析行為學(xué)視頻均利用ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(美國(guó)Stoelting公司開(kāi)發(fā))自動(dòng)分析統(tǒng)計(jì)。本研究EPM統(tǒng)計(jì)光刺激前后,即5min+5min+5min,動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)、進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間;OFT統(tǒng)計(jì)光刺激前后,即10min+10min+10min,動(dòng)物進(jìn)入?yún)^(qū)次數(shù)、進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間。軟件根據(jù)預(yù)先劃定的區(qū)域?qū)⒆詣?dòng)把這些參數(shù)分類(lèi)統(tǒng)計(jì)得到動(dòng)物活動(dòng)情況報(bào)告表格,并繪制小鼠的行為學(xué)數(shù)據(jù)圖。2.6.2、心率數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)每只小鼠在60s+30s(無(wú)光刺激+光刺激)一個(gè)循環(huán)中各個(gè)階段心率的平均值,然后選取5個(gè)循環(huán),再統(tǒng)計(jì)同一只小鼠在不同循環(huán)中對(duì)應(yīng)階段心率均值的均值,導(dǎo)出數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表格,并繪制小鼠的心率變化圖。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1、光遺傳興奮C57小鼠DMH谷氨酸能神經(jīng)元為了研究DMH谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)焦慮情緒能否存在調(diào)控作用,我們將AAV9-CaMKII-ChR2-mcherry病毒蛋白選擇性地表示出在了C57小鼠的DMH區(qū)域(圖1(a))。圖1(b)顯示,光遺傳興奮DMH區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元能導(dǎo)致小鼠心率的上升(未刺激時(shí)心率:(482.8523.37)bpm,刺激時(shí)心率:(523.3426.69)bpm,meanSD(均值標(biāo)準(zhǔn)差),P=0.04208,每組n=8),表示清楚光刺激影響了小鼠的生理狀態(tài)。除此之外,在EPM實(shí)驗(yàn)中(圖1(c-d)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)減少(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):6.572.89,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):1.281.46,meanSD,P=0.00091,每組n=5)且進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間減少(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(38.9813.86)s,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(4.582.54)s,meanSD,P=0.00087,每組n=7)。在OFT測(cè)試實(shí)驗(yàn)中(圖1(e-f)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入?yún)^(qū)域的次數(shù)減少(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):8.453.56,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):3.351.25,meanSD,P=0.00298,每組n=6)且進(jìn)入?yún)^(qū)域的時(shí)間減少(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(30.025.63)s,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(10.232.32)s,meanSD,P=0.00596,每組n=7)。上述結(jié)果表示清楚,光遺傳興奮C57小鼠DMH的谷氨酸能神經(jīng)元后,小鼠心率上升且表現(xiàn)出焦慮樣行為。3.2、光遺傳抑制C57小鼠DMH谷氨酸能神經(jīng)元作為對(duì)照實(shí)驗(yàn),我們將AAV9-CaMKII-NpHR-mcherry病毒蛋白選擇性地表示出在了C57小鼠的DMH區(qū)域(圖2(a))。圖2(b)顯示,光遺傳抑制DMH區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元能導(dǎo)致小鼠心率的下降(未刺激時(shí)心率:(465.8213.21)bpm,刺激時(shí)心率:(413.3421.62)bpm,meanSD,P=0.04988,每組n=8),表示清楚光刺激影響了小鼠的生理狀態(tài)。除此之外,在EPM實(shí)驗(yàn)中(圖2(cd)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)增加(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):2.8722.68,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):4.022.36,meanSD,P=0.04091,每組n=6)且進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間增加(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(8.981.82)s,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(20.015.54)s,meanSD,P=0.00887,每組n=6)。在OFT測(cè)試實(shí)驗(yàn)中(圖2(e-f)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入?yún)^(qū)域的次數(shù)增加(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):5.153.53,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):9.363.28,meanSD,P=0.00908,每組n=6)且進(jìn)入?yún)^(qū)域的時(shí)間增加(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(8.425.69)s,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(20.564.31)s,meanSD,P=0.00896,每組n=6)。上述結(jié)果表示清楚,光遺傳抑制C57小鼠DMH的谷氨酸能神經(jīng)元后,小鼠心率下降且表現(xiàn)出焦慮下降行為。圖1C57小鼠在光遺傳興奮DMH谷氨酸能神經(jīng)元前后的心率和行為變化(*P0.05,**P0.01,***P0.001,配對(duì)t-檢驗(yàn))Fig.1HeartrateandbehaviorchangesofC57micebeforeandduringoptogeneticexcitationofDMHglutamatergicneurons(*P0.05,**P0.01,***P0.001,Pairedt-Test)注:圖(b-f)中,每個(gè)空心球代表每只小鼠的參數(shù),實(shí)心球代表參數(shù)均值3.3、光遺傳興奮GAD-cre小鼠DMH的GABA能神經(jīng)元為了研究DMHGABA能神經(jīng)元對(duì)焦慮情緒能否存在調(diào)控作用,我們將AAV9-DIO-ChR2-mcherry病毒蛋白選擇性地表示出在了GAD-cre小鼠的DMH區(qū)域(圖3(a))。圖3(b)顯示,光遺傳興奮DMH區(qū)域的GABA能神經(jīng)元能導(dǎo)致小鼠心率的上升(未刺激時(shí)心率:(510.8625.36)bpm,刺激時(shí)心率:(573.7224.64)bpm,meanSD,P=0.04758,每組n=8),表示清楚光刺激影響了小鼠的生理狀態(tài)。除此之外,在EPM實(shí)驗(yàn)中(圖3(cd)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)減少(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):13.552.86,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):6.271.96,meanSD,P=0.00791,每組n=7)且進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間減少(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(36.9812.86)s,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(19.586.54)s,meanSD,P=0.00887,每組n=7)。在OFT測(cè)試實(shí)驗(yàn)中(圖3(e-f)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入?yún)^(qū)域的次數(shù)減少(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):8.953.56,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):5.343.25,meanSD,P=0.04498,每組n=6)且進(jìn)入?yún)^(qū)域的時(shí)間減少(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(25.136.63)s,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(9.233.31)s,meanSD,P=0.00996,每組n=7)。上述結(jié)果表示清楚,光遺傳興奮GAD-cre小鼠DMH的GABA能神經(jīng)元后,小鼠心率上升且表現(xiàn)出焦慮樣行為。圖2C57小鼠在光遺傳抑制谷氨酸能神經(jīng)元前后的心率和行為變化(*P0.05,**P0.01,配對(duì)t-檢驗(yàn))Fig.2HeartrateandbehaviorchangesofC57micebeforeandduringoptogeneticinhibitionofDMHglutamatergicneurons(*P0.05,**P0.01,Pairedt-Test)注:圖(b-f)中,每個(gè)空心球代表每只小鼠的參數(shù),實(shí)心球代表參數(shù)均值3.4、光遺傳抑制GAD-cre小鼠DMH的GABA能神經(jīng)元作為對(duì)照實(shí)驗(yàn),我們將AAV9-DIO-NpHR-mcherry病毒蛋白選擇性地表示出在了GAD-cre小鼠的DMH區(qū)域(圖4(a))。圖4(b)顯示,光遺傳抑制DMH區(qū)域的GABA能神經(jīng)元能導(dǎo)致小鼠心率的下降(未刺激時(shí)心率:(480.869.98)bpm,刺激時(shí)心率:(423.398.69)bpm,meanSD,P=0.04678,每組n=6),表示清楚光刺激影響了小鼠的生理狀態(tài)。除此之外,在EPM實(shí)驗(yàn)中(圖4(cd)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)增加(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):2.482.62,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù):3.062.86,meanSD,P=0.04991,每組n=6)且進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間增加(未刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(5.781.52)s,刺激時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間:(16.716.58)s,meanSD,P=0.00985,每組n=6)。在OFT測(cè)試實(shí)驗(yàn)中(圖4(e-f)),光刺激時(shí)小鼠進(jìn)入?yún)^(qū)域的次數(shù)增加(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):4.272.93,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的次數(shù):8.653.78,meanSD,P=0.00848,每組n=6)且進(jìn)入?yún)^(qū)域的時(shí)間增加(未刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(10.774.43)s,刺激時(shí)進(jìn)入?yún)^(qū)的時(shí)間:(23.968.71)s,meanSD,P=0.00856,每組n=6)。上述結(jié)果表示清楚,光遺傳抑制GAD-cre小鼠DMH的GABA能神經(jīng)元后,小鼠心率下降且表現(xiàn)出焦慮下降行為。圖3GAD-cre小鼠在光遺傳興奮DMHGABA能神經(jīng)元前后的心率和行為變化(*P0.05,**P0.01,配對(duì)t-檢驗(yàn))Fig.3HeartrateandbehaviorchangesofGAD-cremicebeforeandduringoptogeneticexcitationofDMHGABAergicneurons(*P0.05,**P0.01,Pairedt-Test)注:圖(b-f)中,每個(gè)空心球代表每只小鼠的參數(shù),實(shí)心球代表參數(shù)均值4、與國(guó)內(nèi)外類(lèi)似研究比照分析關(guān)于DMH,通常人們將其作為自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要部分來(lái)研究,以為DMH直接或間接控制內(nèi)臟和內(nèi)分泌腺體,進(jìn)而調(diào)節(jié)性行為、打斗、心率、血壓、體溫等至關(guān)重要的生理功能,任何微小下丘腦的病變或損傷都會(huì)引起眾多生理活動(dòng)與功能的紊亂和異常[23]。Lpez-Gonzlez等[27]用電刺激麻醉大鼠下丘腦防御區(qū)誘發(fā)心血管加速,而在這里經(jīng)過(guò)腦橋A5區(qū)神經(jīng)元全程介入華而不實(shí)。這一研究結(jié)論講明腦橋A5區(qū)的神經(jīng)元可能介入了由下丘腦防御區(qū)引起的心血管反響機(jī)制。SvozCouche等[28]發(fā)現(xiàn)下丘腦DMH介入了慢性心血管疾病的調(diào)控。但仍較少研究將下丘腦的活動(dòng)與焦慮、緊張、憤怒、沮喪、悲戚、痛苦等負(fù)性情緒的變化聯(lián)絡(luò)在一起[15]。本文的一大創(chuàng)新點(diǎn)就是將DMH與調(diào)控焦慮情緒的經(jīng)典腦區(qū)聯(lián)絡(luò)在一起研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMH介入了焦慮的調(diào)控機(jī)制,并對(duì)DMH進(jìn)行了細(xì)胞分類(lèi)。圖4GAD-cre小鼠在光遺傳抑制DMHGABA能神經(jīng)元前后的心率和行為變化(*P0.05,**P0.01,配對(duì)t-檢驗(yàn))Fig.4HeartrateandbehaviorchangesofGAD-cremicebeforeandduringoptogeneticinhibitionofDMHGABAergicneurons(*P0.05,**P0.01,Pairedt-Test)注:圖(b-f)中,每個(gè)空心球代表每只小鼠的參數(shù),實(shí)心球代表參數(shù)均值另外,與傳統(tǒng)的電刺激DMH的研究方式方法相比,本文采用的光遺傳技術(shù)能在活體動(dòng)物甚至是自由運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物腦內(nèi),精準(zhǔn)地調(diào)控特定種類(lèi)神經(jīng)元的活動(dòng)。華而不實(shí),在時(shí)間上的精到準(zhǔn)確度可到達(dá)毫秒級(jí)別,在空間上的精到準(zhǔn)確度則能到達(dá)單個(gè)細(xì)胞級(jí)別,并且調(diào)控具有細(xì)胞選擇性[29,30]。5、總結(jié)為了研究DMH中不同類(lèi)型的神經(jīng)元在負(fù)性情緒,尤其是焦慮中的作用,本文結(jié)合光遺傳技術(shù)、生理參數(shù)檢測(cè)技術(shù)和行為學(xué)方式方法,對(duì)DMH內(nèi)GABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元的正向激活與反向抑制進(jìn)行特異性調(diào)控,實(shí)現(xiàn)了對(duì)焦慮情緒的雙向調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),光遺傳興奮C57小鼠DMH的谷氨酸能神經(jīng)元,小鼠表現(xiàn)出對(duì)高架十字迷宮開(kāi)放臂和曠場(chǎng)區(qū)域更少的探尋求索行為。與此同時(shí),小鼠心率伴隨光刺激而有所上升,光停止刺激后,心率恢復(fù)到刺激前的水平。結(jié)果提示小鼠行為上表現(xiàn)出焦慮上升,與此同時(shí),生理上伴隨著心率升高。反之,若光遺傳抑制C57小鼠DMH的谷氨酸能神經(jīng)元,小鼠表現(xiàn)出對(duì)高架十字迷宮開(kāi)放臂和曠場(chǎng)區(qū)域更多的探尋求索行為。同時(shí)小鼠心率伴隨光刺激而有所下降,光停止刺激后,心率恢復(fù)到刺激前的水平。講明小鼠行為上表現(xiàn)出焦慮下降,在生理上伴隨著心率下降。這一結(jié)論表示清楚,DMH的谷氨酸能神經(jīng)元可能介入了小鼠焦慮樣情緒的調(diào)控,而且介入了自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心率等生理信號(hào)的調(diào)控。出人意料的是,光遺傳興奮GAD-cre小鼠DMH的GABA能神經(jīng)元,小鼠表現(xiàn)出顯著的焦慮樣行為和心率升高。反之,若光遺傳抑制GAD-cre小鼠DMH的GABA神經(jīng)元,小鼠在行為上表現(xiàn)出焦慮下降,生理上伴隨著心率下降。這一發(fā)現(xiàn)提示,與DMH的谷氨酸能神經(jīng)元的作用一樣,DMH的GABA能神經(jīng)元也介入了小鼠焦慮樣情緒和心率等生理信號(hào)的雙向調(diào)控。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)激活DMH區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元均導(dǎo)致了顯著的焦慮樣行為和心率的顯著上升。反之,抑制這一區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元均引起了焦慮樣行為和心率的顯著下降。這一發(fā)現(xiàn)為DMH介入對(duì)焦慮的調(diào)控提供了直接的證據(jù)。然而,對(duì)于DMH調(diào)控焦慮確實(shí)切神經(jīng)環(huán)路機(jī)制,以及自主神經(jīng)調(diào)節(jié)與情緒調(diào)節(jié)之間的互相作用等問(wèn)題,仍有待進(jìn)一步研究。由于下丘腦各個(gè)核團(tuán)的投射廣泛,神經(jīng)環(huán)路功能復(fù)雜,本文針對(duì)DMH中谷氨酸能細(xì)胞、GABA能細(xì)胞兩類(lèi)細(xì)胞對(duì)心率和焦慮情緒的影響進(jìn)行了初步的研究,發(fā)現(xiàn)了兩者的協(xié)同作用。本研究有望為將來(lái)解析眾多神經(jīng)-精神共患病的調(diào)控機(jī)制提供可能的靶點(diǎn)和理論支持。以下為參考文獻(xiàn)[1]TyeKM,DeisserothK.Optogeneticinvestigationofneuralcircuitsunderlyingbraindiseaseinanimalmodels[J].NatureReviewNeuroscience,20203171(13):251-266.[2]LuY,ZhongC,WangLL,etal.Optogeneticdissectionofictalpropagationinthehippocampalentorhinalcortexstructures[J].NatureCommunications,2021,10962(7):1-11.[3]BoidoD,JesuthasanN,deCurtisM,etal.Networkdynamicsduringtheprogressionofseizure-likeeventsinthehippocampal-parahippocampalregions[J].CerebCortex,2020,24(1):163-173.[4]PazJT,DavidsonTJ,FrechetteES,etal.Closedloopoptogeneticcontrolofthalamusasatoolforinterruptingseizuresaftercorticalinjury[J].NatureNeuroscience,2020,16(1):64-70.[5]EinevollGT,KayserC,LogothetisNK,etalModellingandanalysisoflocalfieldpotentialsforstudyingthefunctionofcorticalcircuits[J].NatureReviewNeuroscience,2020,3599(14):770-785.[6]YizharO,FennoLF,DavidsonTJ,etalOptogeneticsinneuralsystems[J].Neuron,2018,71(1):9-34.[7]GoldbergEM,CoulterDA.Mechanismsofepileptogenesisaconvergenceonneuralcircuitdysfunction[J].NatureReviewNeuroscience2020,3482(14):337-349.[8]WenJL,XueL,WangRH,etal.InvolvementofthedopaminergicsystemintheconsolidationoffearconditioninginhippocampalCA3subregion[J].BehaviouralBrainResearch,2021,278:527-534.[9]TangH,WuGS,XieJ,etal.Brain-widemapofprojectionsfrommiceventralsubiculum[J]NeuroscienceLetters,2021,629:171-179.[10]WangY,XuCL,XuZB,etal.DepolarizedGABAergicsignalinginsubicularmicrocircuitsmediatesgeneralizedseizureintemporallobeepilepsy[J].Neuron,2021,95(1):92-105.[11]JanakPH,TyeKM.Fromcircuitstobehaviourintheamygdala[J].Nature,2021,517(7534):284-292.[12]Mndez-BrtoloC,MorattiS,ToledanoR,etal.Afastpathwayforfearinhumanamygdala[J]NatureNeuroscience,2021,19(8):1041-1049.[13]LikhtikE,StujenskeJM,TopiwalaMA,etalPrefrontalentrainmentofamygdalaactivitysignalssafetyinlearnedfearandinnateanxiety[J].NatureNeuroscience,2020,17(1):106-113.[14]McCulloughKM,ChoiD,GuoJD,etal.MolecularcharacterizationofThy1expressingfear-inhibitingneuronswithinthebasolateralamygdala[J].NatureCommunications,2021,7:1-13.[15]GrossCT,CanterasNS.Themanypathstofear[J]NatureReviewNeuroscience,2020,13(9):651-658.[16]SantosJM,MacedoCE,Brand?oML.Gabaergicmechanismsofhypothalamicnucleiintheexpressionofconditionedfear[J].NeurobiologyofLearningandMemory,2008,90(3):560-568.[17]LissekS,GolischA,GlaubitzB,etal.TheGABAergicsysteminprefrontalcortexandhippocampusmodulatescontext-relatedextinctionlearning[J].BrainImagingandBehavior,2021,11(16):1885-1900.[18]SilvaJrLG,deMenezesRCA,dosSantosRAS,etal.Roleofperiaqueductalgrayonthecardiovascularresponseevokedbydisinhibitionofthedorsomedialhypothalamus[J].BrainResearch2003,98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