新分子學(xué)技術(shù)在產(chǎn)前診斷非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用SOGC【摘要】目的綜述分子學(xué)技術(shù)在快速產(chǎn)前診斷胎兒非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用進(jìn)展,及尚處于研發(fā)階段的新性技術(shù).局限性本文僅初步探討了快速非整倍性染色體疾病診斷的方案.證據(jù)來(lái)源MEDLINE數(shù)據(jù)庫(kù)1992年至今的相關(guān)文獻(xiàn),本文提供其摘要信息.證據(jù)價(jià)值本報(bào)道所涉及技術(shù)進(jìn)展由加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)基因委員會(huì)提供,由加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)執(zhí)行委員會(huì)批準(zhǔn).收益、風(fēng)險(xiǎn)及成本本進(jìn)展提供了分子學(xué)技術(shù)快速診斷非整倍性染色體疾病的方法,以及支持上述技術(shù)在胎兒產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用的證據(jù).此類(lèi)方法在診斷胎兒非整倍性染色體疾病方面具有可靠、低成本的特點(diǎn),但在診斷整倍體性的染色體畸變等疾病方面,部分疾病雖然臨床特征很顯著,這些分子學(xué)技術(shù)仍顯示出不足之處.【期刊名稱(chēng)】《中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志（電子版）》【年(卷),期】2010(002)003【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P55-59)【作者】SOGC【作者單位】【正文語(yǔ)種】中文簡(jiǎn)要說(shuō)明目前可利用的非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法包括熒光原位雜交（FISH）及定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）。多樣性連接依賴(lài)的探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）是仍處于研究階段的新技術(shù)。FISHQF-PCR（MLPA），在細(xì)胞遺傳學(xué)全核型分析方面擁有相似的敏感性和特異性（13、18、21色體的“金標(biāo)準(zhǔn)”）。MLPA和QF-PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于顯著地降低了檢測(cè)時(shí)間，且自動(dòng)化檢測(cè)批量樣本使得單位樣本的檢測(cè)費(fèi)用大大降低。FISH技術(shù)難以做到自動(dòng)化，仍比PCR技術(shù)檢測(cè)費(fèi)用高。目前非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法的主要缺陷是無(wú)法檢測(cè)目標(biāo)染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變。其中一些疾病在臨床上可預(yù)測(cè)有一定的發(fā)病率。未來(lái)，RAD技術(shù)可能適合胎兒非整倍體畸形風(fēng)險(xiǎn)增加而需侵入性診斷明確的孕婦，但不適合有其他風(fēng)險(xiǎn)如B超提示的胎兒結(jié)構(gòu)異常或有染色體重排（如平衡易位）的個(gè)人或家族史者。此類(lèi)孕婦仍需進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)全核型分析。在產(chǎn)前診斷中引入這項(xiàng)新技術(shù)時(shí)應(yīng)該綜合分析它所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)、收益和成本。RAD色體疾病的診斷。本文僅綜述該領(lǐng)域當(dāng)前的臨床和科學(xué)研究進(jìn)展。文中所涉及內(nèi)容不應(yīng)作為授課內(nèi)容或成為指導(dǎo)臨床治療和操作的依據(jù)。各地學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)可以對(duì)本文內(nèi)容和觀點(diǎn)做修正。若根據(jù)當(dāng)?shù)厮胶颓闆r作相應(yīng)修正的，需做好備案或記錄。若未獲得SOGC組織書(shū)面許可，禁止以任何形式復(fù)制本文內(nèi)容。引言加拿大預(yù)防及健康中心推薦產(chǎn)前篩查染色體疾病，特別是對(duì)唐氏綜合征的篩查，并允許孕婦自己做出是否繼續(xù)妊娠的選擇［1］。通過(guò)羊水穿刺或絨毛膜活檢技術(shù)進(jìn)行的檢查有0.5%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，且上述技術(shù)受到有限公共醫(yī)療資源的限制而不能推廣。因此，新的指南建議通過(guò)非侵入性方法篩選唐氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦作為侵入性檢查的對(duì)象［2］。除了診斷唐氏綜合征、13和18三體，在某些情況下仍需用到侵入性檢查。例如B超發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，或父母一方有染色體重排可能造成胎兒染色體異常時(shí)，其他類(lèi)型的染色體異常（缺失或重疊）風(fēng)險(xiǎn)增加，仍需用到侵入性檢查。G顯帶全核型分析是目前對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體病標(biāo)準(zhǔn)的侵入性檢查方法，檢出率大于1／300，這和該技術(shù)導(dǎo)致的流產(chǎn)率接近。核型分析在診斷常染色體13、18、21三倍體和性染色體一些非倍數(shù)性畸變時(shí)有100%的敏感性和特異性，這些畸形占胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的大部分且與孕婦年齡偏大有關(guān)［3］。此外，核型分析在檢測(cè)其他染色體畸形時(shí)也有作用，包括數(shù)目上（如三體和特定結(jié)構(gòu)異常染色體）和結(jié)構(gòu)上（缺失、易位、倒置或插入），其分辨能力在1000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)左右。這種染色體畸變常與母親年齡無(wú)明顯關(guān)系且與生化篩查結(jié)果無(wú)關(guān)，常為偶然發(fā)現(xiàn)或超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)檢出［4，5］。核型分析也有很多應(yīng)用上的局限［6］。由于檢測(cè)需要細(xì)胞培養(yǎng)和收獲，同時(shí)需要大量實(shí)驗(yàn)分析處理，故全核型分析需要7～14天時(shí)間。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的核型分析費(fèi)用不一，平均一次全核型分析大約需要500加元，包括材料和技術(shù)人員時(shí)間（J.Chernos，personalcommunication，June2006）。為研制有力的分子基因此可以提供更加快捷的檢測(cè)結(jié)果同時(shí)降低醫(yī)療費(fèi)用，節(jié)約醫(yī)療資源。這種新方法的主要缺陷是無(wú)法檢測(cè)目標(biāo)染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變，而其中一些疾病在臨床上有顯著的發(fā)病率。非整倍性染色體疾病快速診斷方法目前臨床應(yīng)用的有效的RAD檢測(cè)技術(shù)主要有2種：FISH和QF-PCR，需要指出的是它們作為核型分析的補(bǔ)充，而不是替代。MLPA是一項(xiàng)針對(duì)其他適應(yīng)證的新技術(shù)，目前仍處于研究階段，將來(lái)可能用于產(chǎn)前診斷。熒光原位雜交（FISH）FISHDNA13、1821XY10010%～15%的染色體鑲嵌，該水平近似于全核型分析。FISH和高齡妊娠附加檢查，以便為決定終止妊娠的夫婦提供更快速的診斷。FISH11點(diǎn)基因缺失綜合征，與某些心臟畸形有關(guān)）或者夫婦已生育一染色體微缺失的后代。FISH100%［10］FISHFISH［10，11］。FISHFISH核型分析使得費(fèi)用加倍，可達(dá)1000美元（J.Chernos，personalcommunication，June2006）。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一項(xiàng)公認(rèn)的分子遺傳學(xué)技術(shù)，它通過(guò)特異性引DNA（QF-PCR）是一項(xiàng)可以測(cè)量DNA序列拷貝數(shù)的新技術(shù)［11-13］。通過(guò)QF-PCR技術(shù)，科學(xué)家可以對(duì)未培養(yǎng)的羊水細(xì)胞或絨毛中提取的DNA中感興趣的染色體上（13，18，21，X和Y）特異的DNA多態(tài)性標(biāo)記物進(jìn)行擴(kuò)增。熒光標(biāo)記引物結(jié)合到每個(gè)靶序列，使DNA聚合酶鏈復(fù)制，合成雙鏈DNA。擴(kuò)增后，毛細(xì)管電泳分離產(chǎn)物。計(jì)算機(jī)輔助測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度可以測(cè)量每個(gè)靶序列即每個(gè)染色體的拷貝數(shù)。QF-PCR產(chǎn)前診斷。QF-PCR95.6599.97%［10］。此外，這一技術(shù)還可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出三倍體。QF-PCR［18］。由于母源細(xì)胞污棱兩可的，通過(guò)比較母親的血液樣本可以用來(lái)作出裁決［11］。這一技術(shù)相比FISH的主要優(yōu)點(diǎn)是易于自動(dòng)化操作和樣本的定量，從而降低成本至每樣本約20美元［10］QF-PCR多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）PCRDNA［19］MLPADNA1根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可以測(cè)量靶序列甚至每條染色體的拷貝數(shù)。MLPA于非整倍體檢測(cè)的產(chǎn)前診斷應(yīng)用［20-23］。然而，這一新技術(shù)并未被那些使用FISH或QF-PCR的研究中心作為常規(guī)的檢測(cè)方法。MLPA技術(shù)還有其他方面的應(yīng)用，包括結(jié)合FISH技術(shù)進(jìn)行微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷。目前，更多研究專(zhuān)注于一些MLPA試劑盒的研發(fā)，以此來(lái)進(jìn)行一些其他方法不能檢測(cè)的疾病的產(chǎn)前診斷（例如Prader-Willi和Angelman）。MLPAQFPCR［21］。目前已報(bào)道的非嵌合體性非整倍體異常10099.852740）。當(dāng)然這一技術(shù)也有合體異常的檢測(cè)靈敏度；以及該檢測(cè)方法比較費(fèi)時(shí)。MLPA目前仍處于研究階段，尚無(wú)法廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。討論我們已經(jīng)分析了RAD檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)及其局限性。顯然，分子遺傳學(xué)作為一個(gè)輔助手段，在染色體疾病的產(chǎn)前診斷方面有積極的推動(dòng)作用，而不是替代細(xì)胞遺傳學(xué)。FISH和QF-PCR技術(shù)是眾所周知的，而MLPA檢測(cè)法的在胎兒非整倍體檢測(cè)方面（13、1821及性染色體異常）的靈敏度及特異度同全核型分析無(wú)差。而QF-PCR和MLPAFISH動(dòng)化檢測(cè)，并且成本高于基于PCR的其他檢測(cè)方法。在加拿大大多數(shù)的研究中心，會(huì)對(duì)一些高風(fēng)險(xiǎn)妊娠孕婦進(jìn)行RAD檢測(cè)（主要是FISH），因?yàn)檫@可以更快地提供結(jié)果給她們以決定是否終止妊娠。RAD檢測(cè)資格是基于地區(qū)確定的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)定的，這需要考慮到額外的成本、陽(yáng)性結(jié)果的可能性、20FISHFISHQF-PCR［5，13，17，24-27］QF-PCR10013、1821X有超聲檢測(cè)出異常的病例（3.5mm）或者有疾病遺傳史的孕婦，全核型分析作為備用培養(yǎng)檢測(cè)方式是必要的。另一個(gè)支持RAD檢測(cè)的理由是這可以避免使用侵入性方法對(duì)罕見(jiàn)的染色體異常進(jìn)行不必要的檢測(cè)鑒定（13、1821）。染色體異常預(yù)測(cè)結(jié)果通常是沒(méi)有或者不確定，這在遺傳咨詢(xún)上臨床意義的表述是有困難的，這有可能會(huì)引起孕婦夫婦的焦慮，可能會(huì)導(dǎo)致想繼續(xù)妊娠的孕婦選擇終止妊娠。然而事實(shí)上，其他染色體異常的預(yù)測(cè)（或有可能）有臨床意義，Ogileve等［24］非整倍體染色體異常的檢測(cè)率在產(chǎn)前和產(chǎn)后是相似的。孕婦通常因?yàn)閼延蟹钦扼w胎兒風(fēng)險(xiǎn)較高而要承受侵入性檢測(cè)，但其實(shí)她們生育非整倍體染色體異常胎兒的風(fēng)險(xiǎn)并不比未選中的妊娠婦女高［4］。在產(chǎn)前診斷方面，如同其他醫(yī)療領(lǐng)域，進(jìn)展的衡量標(biāo)準(zhǔn)是隨著時(shí)間的推移是否可以為患者提供更多的信息和選擇（例如，更多的篩查方法選擇和更好的診斷性檢測(cè)）然而在某些情況下，僅做RAD而不是更多。分子生物學(xué)技術(shù)很可能成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵，從而可以向患者提供更多的信息。MLPA和微陣列分析（Rickman等［3，28］的綜述）這些最佳的技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)更多的疾病，同時(shí)，生物技術(shù)行業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)也大大降低了檢測(cè)的成本。可以想象在不遠(yuǎn)的將來(lái)，接受羊水穿刺的婦女可以通過(guò)這一項(xiàng)檢查來(lái)選擇檢測(cè)全部或者部分染色體非整倍體異常，而所需的費(fèi)用比目前的核型分析要低。詞匯表非整倍體：染色體數(shù)目不是23的整倍數(shù)，通常是指在配子產(chǎn)生過(guò)程中由于減數(shù)分裂時(shí)未發(fā)生分離錯(cuò)誤引起的。常染色體：除了性染色體外的其他染色體。染色體：包含一條DNA單鏈的線性結(jié)構(gòu)，人體通常含有46條染色體，分成23對(duì)。DNA雜交：標(biāo)記的DNA探針與互補(bǔ)的靶序列結(jié)合。染色體組型：一個(gè)人的染色體組成，即個(gè)體的染色體顯微照片，系統(tǒng)地排列成23對(duì)。單體型：1條染色體缺失。嵌合型：個(gè)體或組織中存在2個(gè)或更多不同基因型的細(xì)胞系。染色體數(shù)量畸變：染色體數(shù)量不是46。染色體結(jié)構(gòu)畸變：染色體數(shù)量為46，但存在部分染色體缺失（刪除）、增加（插入）或重排（易位或倒置）。三倍體：1條染色體數(shù)量為69（每條染色體存在3份拷貝）。三體型：存在1條額外的染色體。參考文獻(xiàn)［1］DickPT.Periodichealthexamination，1996update：1.PrenatalscreeningforanddiagnosisofDownsyndrome.CanadianTaskForceonthePeriodicHealthExamination［J］.CMAJ，1996，154：465-479.［2］SummersAM，LangloisS，WyattP，etal.Prenatalscreeningforfetalaneuploidy［J］.JObstetGynaecolCan，2007，29：146-161.［3］RickmanL，F(xiàn)ieglerH，Shaw-SmithC，etal.PrenataldetectionofunbalancedchromosomalrearrangementsbyarrayCGH［J］.JMedGenet，2006，43：353-361.［4］RyallRG，CallenD，CoccioloneR，etal.KaryotypesfoundinthepopulationdeclaredatincreasedriskofDownsyndromefollowingmaternalserumscreening［J］.PrenatDiagn，2001，21：553-557.［5］LeungWC，LauET，LaoTT，etal.Canamnio-polymerasechainreactionalonereplaceconventionalcytogeneticstudyforwomenwithpositivebiochemicalscreeningforfetalDownsyndrome［J］？ObstetGynecol，2003，101：856-861.［6］ShafferLG，BejjaniBA.Acytogeneticist'sperspectiveongenomicmicroarrays［J］.HumReprodUpdate，2004，10：221-226.［7］KlingerK，LandesG，ShookD，etal.Rapiddetectionofchromosomeaneuploidiesinunculturedamniocytesbyusingfluorescenceinsituhybridization（FISH）［J］.AmJHumGenet，1992，51：55-65.［8］BryndorfT，ChristensenB，VadM，etal.Prenataldetectionofchromosomeaneuploidiesbyfluorescenceinsituhybridization：experiencewith2000unculturedamnioticfluidsamplesinaprospectivepreclinicaltrial［J］.PrenatDiagn，1997，17：333-341.［9］TepperbergJ，PettenatiMJ，RaoPN，etal.Prenataldiagnosisusinginterphasefluorescenceinsituhybridization（FISH）：2-yearmulti-centerretrospectivestudyandreviewoftheliterature［J］.PrenatDiagn，2001，21：293-301.［10］GrimshawGM，SzczepuraA，HultenM，etal.Evaluationofmoleculartestsforprenataldiagnosisofchromosomeabnormalities［J］.HealthTechnolAssess，2003，7：1-146.［11］MannK，DonaghueC，F(xiàn)oxSP，etal.Strategiesfortherapidprenataldiagnosisofchromosomeaneuploidy［J］.EurJHumGenet，2004，12：907-915.［12］MansfieldES.DiagnosisofDownsyndromeandotheraneuploidiesusingquantitativepolymerasechainreactionandsmalltandemrepeatpolymorphisms［J］.HumMolGenet，1993，2：43-50.［13］SchmidtW，JendernyJ，HecherK，etal.DetectionofaneuploidyinchromosomesX，Y，13，18and21byQF-PCRin662selectedpregnanciesatrisk［J］.MolHumReprod，2000，6：855-860.［14］PertlB，PieberD，Lercher-HartliebA，etal.RapidprenataldiagnosisofaneuploidybyquantitativefluorescentPCRonfetalsamplesfrommothersathighriskforchromosomedisorders［J］.MolHumReprod，1999，5：1176-1179.［15］CiriglianoV，EjarqueM，CanadasMP，etal.Clinicalapplicationofmultiplexquantitativefluorescentpolymerasechainreaction（QF-PCR）fortherapidprenataldetectionofcommonchromosomeaneuploidies［J］.MolHumReprod，2001，7：1001-1006.［16］CiriglianoV，EjarqueM，F(xiàn)usterC，etal.XchromosomedosagebyquantitativefluorescentPCRandrapidprenataldiagnosisofsexchromosomeaneuploidies［J］.MolHumReprod，2002，8：1042-1045.［17］LeungWC，WatersJJ，ChittyL.Prenataldiagnosisbyrapidaneuploidydetectionandkaryotyping：aprospectivestudyoftheroleofultrasoundin1589second-trimesteramniocenteses［J］.PrenatDiagn，2004，24：790-795.［18］DonaghueC，MannK，DochertyZ，etal.DetectionofmosaicismforprimarytrisomiesinprenatalsamplesbyQFPCRandkaryotypeanalysis［J］.PrenatDiagn，2005，25：65-72.［19］SchoutenJP，McElgunnCJ，WaaijerR，etal.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexligation-dependentprobeamplification［J］.NucleicAcidsRes，2002，30：e57.［20］GerdesT，KirchhoffM，LindAM，etal.Computer-assistedprenatalaneuploidyscreeningforchromosome13，18，21，XandYbasedonmultiplexligation-dependentprobeamplification（MLPA）［J］.EurJHumGenet，2005，13：171-175.［21］HochstenbachR，MeijerJ，vandeBJ，etal.Rapiddetectionofchromosomalaneuploidiesinunculturedamniocytesbymultiplexligation-dependentprobeamplification（MLPA）［J］.PrenatDiagn，2005，25：1032-1039.［22］GerdesT，KirchhoffM，BryndorfT.Automaticanalysisofmultiplexligation-dependentprobeamplificationproducts（exemplifiedbyacommercialkitforprenatalaneuploidydetection）［J］.Electrophoresis，2005，26：4327-4732.［23］SlaterHR，BrunoDL，RenH，etal.Rapid，highthroughputprenataldetectionofaneupl