會(huì)計(jì)學(xué)1DDRTPCR技術(shù)研究進(jìn)展DDRT—PCR早期，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平篩選差異表達(dá)基因的方法是差別篩選技術(shù)和扣除雜交法，但二者存在靈敏度低、工作量大、周期長(zhǎng)及步驟繁瑣的問(wèn)題。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Liang和Struss博士發(fā)明了mRNA差異顯示技術(shù)，即DDRT—PCR(differ—entialdisplayofmRNAbyPCR)。

1994年，ErricHaay等將這種方法正式命名為差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRNADifferentialDisplayPCR)，簡(jiǎn)稱DDRT—PCR第1頁(yè)/共16頁(yè)

mRNA差異顯示技術(shù)的基本原理及實(shí)驗(yàn)步驟

1.1mRNA差異顯示技術(shù)的基本原理首先，用3’端錨定引物(AnchorPrimer)(dT)VN作為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞總mRNA，合成第一鏈cDNA；然后，在用放射性同位素標(biāo)記的dNTP存在的情況下，用隨機(jī)引物(ArbitraryPrimer)和與反轉(zhuǎn)錄引物相同的錨定引用進(jìn)行PCR，隨機(jī)擴(kuò)增cDNA片段；將PCR產(chǎn)物在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，通過(guò)放射自顯影展示并回收多態(tài)cDNA片段(即EST)；第2頁(yè)/共16頁(yè)

將差異帶二次PCR擴(kuò)增并通過(guò)Northern雜交來(lái)驗(yàn)證、克隆、測(cè)序差異cDNA片段。將所得片段用BLAST與Gen．Bank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的已知序列做比較，確定片段是否是新序列(基因)。

第3頁(yè)/共16頁(yè)2mRNA差異顯示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

1優(yōu)點(diǎn)周期短，操作簡(jiǎn)便，省去了cDNA克隆和隨后的克隆篩選工作，比遞減雜交要迅速；可同時(shí)比較2個(gè)以上時(shí)空特異性及物種特異性表達(dá)基因；靈敏度高，所需RNA的量少，該法用PCR擴(kuò)增，每做100個(gè)反應(yīng)只需1IxgmRNA，而遞減雜交則需50Ixg；另外，這種方法的重現(xiàn)性好，在相同條件下重復(fù)率可達(dá)90％～95％，大大提高了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

第4頁(yè)/共16頁(yè)2缺點(diǎn)

擴(kuò)增片段短、假陽(yáng)性高、檢測(cè)全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表達(dá)的時(shí)效性影響等。而最大的問(wèn)題還是假陽(yáng)性太高。據(jù)研究，假陽(yáng)性高達(dá)70%

所謂假陽(yáng)性指克隆的DNA片段用Northern雜交時(shí)，沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)第5頁(yè)/共16頁(yè)3DD-PCR中的主要問(wèn)題及解決辦法內(nèi)部因素：試劑、酶的質(zhì)量，引物的類型和純度，RNA的完整性、濃度和純度等

外部因素：試驗(yàn)設(shè)計(jì)、適當(dāng)?shù)膬?nèi)部控制、回收帶的標(biāo)準(zhǔn)、反應(yīng)體系的建立、PCR管的類型及研究者操作的熟練程度等。產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因分析第6頁(yè)/共16頁(yè)3.2改進(jìn)DD-PCR方法

(1)用無(wú)RNA酶的DNA酶處理總RNA，防止DNA污染。

(2)使用Tag酶時(shí)，批號(hào)應(yīng)相同，不要經(jīng)常調(diào)換。

(3)PCR循環(huán)次數(shù)減至30次，提高退火溫度，減少非特異性條帶。

(4)把從測(cè)序膠上切下來(lái)的條帶純化后分成兩部分，一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆。

(5)改變引物長(zhǎng)度，如有的在3′端錨定引物和5′端各加上10個(gè)堿基，帶上EcoRI雙酶切位點(diǎn)，如此可顯著提高重復(fù)性。第7頁(yè)/共16頁(yè)3.4克隆差異片段小的解決方法

差異顯示得到的片段較小，不能代表真正差異表達(dá)的基因。為了得到全長(zhǎng)的基因，傳統(tǒng)方法是采用cDNA探針從cDNA文庫(kù)中篩選，比較復(fù)雜。目前,人們多采用Lauren等創(chuàng)造的mRNA5′端逐漸步移技術(shù)，以步移法獲取的片段大小多在1～1.5kb之間。另外還有一種叫RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)的方法，也比較快速，簡(jiǎn)便。第8頁(yè)/共16頁(yè)4引物的改進(jìn)

起初Liang等設(shè)計(jì)的引物采用了12種錨定寡聚脫氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MN和20種不同的隨機(jī)引物，缺點(diǎn)：不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，由于隨機(jī)引物長(zhǎng)度短導(dǎo)致結(jié)果代表性差，而且得到的擴(kuò)增片段也較小，所以差異條帶易呈現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。第9頁(yè)/共16頁(yè)

Ito等將原本有兩個(gè)固定堿基的3’端錨定引物變?yōu)橹挥幸粋€(gè)固定堿基，使原來(lái)l2種引物減至3種(oligodT12A，oligodT12C，oligodT12G)，

優(yōu)點(diǎn)：減少了每個(gè)mRNA樣品對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)種類的需要，并且把由于簡(jiǎn)并性引起的某些RNA代表性差和RNA數(shù)量過(guò)多而引起假陽(yáng)性的現(xiàn)象降到最低程度。隨后又有研究人員對(duì)5’端引物進(jìn)行了改進(jìn)，隨機(jī)引物條數(shù)改為8條，而且在兩端引物上都帶上了HindllI酶切位點(diǎn)，使得差異表達(dá)片段的克隆變得更加簡(jiǎn)便第10頁(yè)/共16頁(yè)5mRNA差異顯示技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

欒新紅等，利用改進(jìn)后的銀染DD—PCR法篩選小鼠肝臟中差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行鑒定，采用BLAST軟件對(duì)陽(yáng)性片段進(jìn)行同源性分析。結(jié)果：經(jīng)反向Northernblot和測(cè)序鑒定后，獲得了7條陽(yáng)性差異表達(dá)基因片段(DD—ESTs)，其中有2條DD—ESTs只在游泳疲勞組表達(dá)，2條呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，另3條呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)第11頁(yè)/共16頁(yè)5mRNA差異顯示技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

孟元光等應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)，篩選子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)基因片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自定義的T1.7基因片段在于官內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)．在增生的子宮內(nèi)膜組織中呈低表達(dá)，在正常子宮內(nèi)膜組織中不表達(dá)。因而得出結(jié)論T1．7基因片段可能是子宮內(nèi)膜癌新的相關(guān)基因片段。

第12頁(yè)/共16頁(yè)5mRNA差異顯示技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用利用DDRT—PCR對(duì)不同生理狀態(tài)或病理過(guò)程中基因表達(dá)進(jìn)行分析，能揭示生理活動(dòng)或病理過(guò)程的分子機(jī)制：

Li等采用DDRT—PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)梅山豬甲狀腺激素β亞基過(guò)量表達(dá)，分析推測(cè)認(rèn)為，β亞基的過(guò)量表達(dá)很可能是梅山豬比白豬合成系早達(dá)到性成熟的原因；嚴(yán)云勤等發(fā)現(xiàn)豬腎皮質(zhì)中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)mRNA活性很高，而髓質(zhì)中卻無(wú)EGFmRNA活性。第13頁(yè)/共16頁(yè)

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