EnzymeEngineering

酶工程第三章酶的生產(chǎn)制備

酶的生產(chǎn)方式1.提取法:植物、動物、微生物2.化學合成法生物合成法：利用植物、動物、微生物細胞合成。上個世紀50年代起利用微生物生產(chǎn)酶。1949年細菌發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶上個世紀70年代以來利用植物細胞和動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)酶。

木瓜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)血纖維蛋白溶酶原激活劑動植物細胞培養(yǎng)的特殊性：

1、細胞比微生物細胞大得多，體積大幾千倍，2、對剪切力敏感，動物細胞沒有細胞壁更甚3、生長速率比微生物低，生長倍增時間和發(fā)酵周期均更長，4、對營養(yǎng)的要求較微生物復雜，動物細胞往往需要添加血清和其他營養(yǎng)成分3、酶的發(fā)酵生產(chǎn)經(jīng)過預先設計，通過人工操作控制，利用細胞的生命活動，產(chǎn)生人們所需要的酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

第一節(jié)酶的生產(chǎn)菌種一、生產(chǎn)菌種1.細菌芽孢桿菌（蠟狀、枯草、地衣）、大腸桿菌2.霉菌黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌啤酒酵母、假絲酵母4.放線菌鏈霉菌二、產(chǎn)酶菌種的要求（1）不是致病菌及產(chǎn)生有毒物質(zhì)或其他生理活生物質(zhì)的微生物，確保酶生產(chǎn)和應用的安全。（2）能在便宜的底物上生長良好，繁殖快，產(chǎn)酶量高，有利于縮短生周期（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。（4）目標酶的產(chǎn)量要高，性能符合應用需要，產(chǎn)生的酶容易分離純化，最好為胞外酶。（5）除蛋白酶生產(chǎn)菌種外，其他產(chǎn)酶菌種的產(chǎn)蛋白酶活力應該很低，防止目標酶的水解。三.產(chǎn)酶微微生物的分分離和篩選選1)樣品的的采集:從從富含該酶作用底底物的場所采集集樣品2)富集培培養(yǎng):投投其所好，，取其所抗抗3)分離獲獲得微生物物的純培養(yǎng)養(yǎng)（pureculture）。4)初篩：：選出產(chǎn)酶酶菌種，以以多為主。。5)復篩：：選出產(chǎn)酶酶水平相對對較高的菌菌株，以質(zhì)質(zhì)為主。-淀粉酶的的篩選蛋白酶產(chǎn)生生菌的獲得得方法應用含酪蛋蛋白的培養(yǎng)養(yǎng)基第二節(jié)酶酶的發(fā)酵酵技術一、培養(yǎng)基基C/N:產(chǎn)酶促進劑劑:誘導物表面活性劑劑二、發(fā)酵條條件對產(chǎn)酶酶的影響溫度、pH值、通風風量三、發(fā)酵方方法1、固體培培養(yǎng)發(fā)酵：：培養(yǎng)基以麩麩皮、米糠糠等為主要要原料加入入其它營養(yǎng)養(yǎng)成分，經(jīng)經(jīng)滅菌、接接產(chǎn)酶菌株株，在一定定條件下發(fā)發(fā)酵，目的的獲得淀粉粉酶和蛋白白酶，如酒酒曲生產(chǎn)。。2、液體深深層發(fā)酵液體培養(yǎng)基基，在發(fā)酵酵容器中，，經(jīng)滅菌、、冷卻接入入產(chǎn)酶細胞胞，在一定定條件下發(fā)發(fā)酵，是目目前酶生產(chǎn)產(chǎn)的主要方方法。3、固定化化細胞發(fā)酵酵第三節(jié)提提高酶產(chǎn)產(chǎn)量的方法法一、、酶酶合合成成的的調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)機機制制1.操操縱縱子子調(diào)節(jié)節(jié)基基因因：：阻遏遏蛋蛋白白輔阻阻遏遏物物2、、誘誘導導和和阻阻遏遏誘導導：：誘導導物物的的加加入入后后，，酶酶才才大大量量合合成成，，參與與分分解解代代謝謝的的酶酶：：淀淀粉粉酶酶、、纖纖維維素素酶酶阻遏遏：：末端端代代謝謝物物阻阻遏遏：：反饋饋阻阻遏遏，，合合成成代代謝謝中中的的關關鍵鍵酶酶分解解代代謝謝物物阻阻遏遏：：1.酶酶合合成成的的誘誘導導加進進某某種種物物質(zhì)質(zhì)，，使使酶酶生生物物合合成成開開始始或或加加速速進進行行。。酶合合成成誘誘導導的的現(xiàn)現(xiàn)象象：：已知知分分解解利利用用乳乳糖糖的的酶酶有有：：-半乳乳糖糖苷苷酶酶；；-半乳乳糖糖苷苷透透過過酶酶；；硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷轉轉乙乙酰酰酶酶。實驗驗：：（1））大大腸腸桿桿菌菌生生長長在在葡葡萄萄糖糖培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上時時，，細細胞胞內(nèi)內(nèi)無無上上述述三三種種酶酶合合成成；；（2））大大腸腸桿桿菌菌生生長長在在乳乳糖糖培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上時時，，細細胞胞內(nèi)內(nèi)有有上上述述三三種種酶酶合合成成；；（3））表表明明菌菌體體生生物物合合成成的的經(jīng)經(jīng)濟濟原原則則：：需要要時時才才合合成成。調(diào)節(jié)節(jié)基基因因操縱縱基基因因乳糖糖結結構構基基因因PLacZLacYLacamRNA阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））基因關閉啟動動子子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、、乳乳糖糖操操縱縱子子的的結結構構B、、乳乳糖糖酶酶的的誘誘導導乳糖阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））誘導導2.末末端端產(chǎn)產(chǎn)物物阻阻遏遏由某某代代謝謝途途徑徑末末端端產(chǎn)產(chǎn)物物的的過過量量累累積積引引起起的的阻阻遏遏。酶合合成成阻阻遏遏的的現(xiàn)現(xiàn)象象：：實驗：（1）大腸桿菌菌生長在無機機鹽和葡萄糖糖的培養(yǎng)基上上時，檢測測到細胞內(nèi)有有色氨酸合成成酶的存在；；

（2））在上述培養(yǎng)養(yǎng)基中加入色色氨酸，檢測測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)內(nèi)色氨酸合成成酶的活性降降低，直至消消失。（（3）表明色色氨酸的存在在阻止了色氨氨酸合成酶的的合成，體現(xiàn)現(xiàn)了菌體生長長的經(jīng)濟原則則:不需要就不合合成。色氨酸操縱子子——酶的阻阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能能與操縱基因因結合，結構構基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻阻遏蛋白結合合，使之構象象發(fā)生變化,與操縱基因因結合，結構構基因不能表表達酶的誘導和阻阻遏操縱子模模型B.有活性阻阻遏蛋白加誘誘導劑A.有活性阻阻遏蛋白C.無活性阻阻遏蛋白D.無活性阻阻遏蛋白加輔輔阻遏劑操縱基因啟動基因調(diào)節(jié)基因結構基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合,結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產(chǎn)物3.分解代謝謝物阻遏指細胞內(nèi)同時時有兩種分解解底物（碳源源或氮源）存存在時，利用用快的那種分分解底物會阻阻遏利用慢的的底物的有關關酶合成的現(xiàn)現(xiàn)象。分解代謝物的的阻遏作用，，并非由于快快速利用的甲甲碳源本身直直接作用的結結果，而是通通過甲碳源（（或氮源等））在其分解過過程中所產(chǎn)生生的中間代謝謝物所引起的的阻遏作用。。分解代謝物阻阻遏現(xiàn)象：實驗：細菌在含有葡葡萄糖和乳糖糖的培養(yǎng)基上上生長，優(yōu)先先利用葡萄糖糖。待葡萄糖糖耗盡后才開開始利用乳糖糖，產(chǎn)生了兩兩個對數(shù)生長長期中間隔開開一個生長延延滯期的“二二次生長現(xiàn)象象”(diauxie或或biphasicgrowth）。這一現(xiàn)象又稱稱葡萄糖效應應，產(chǎn)生的原原因是由于葡葡萄糖降解物物阻遏了分解解乳糖酶系的的合成。此調(diào)節(jié)基因的的產(chǎn)物是環(huán)腺腺苷酸受體蛋蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部部位RNA聚合酶酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解解物基因活化化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)三、提高酶產(chǎn)產(chǎn)量的策略（一）菌種選選育（一勞永永逸）1.誘變育種種(1)使誘導型變?yōu)闉榻M成型———選育組成型型突變株(2)使阻遏遏型變?yōu)槿プ枳瓒粜瓦x育營養(yǎng)缺陷陷型突變株解除反饋阻遏遏選育結構類似似物抗性突變變株解除分解代謝謝物阻遏———選育抗分解解代謝阻遏突突變株2.基因工程育種種二、提高酶產(chǎn)量量的策略（一）菌種選選育（一勞永永逸）1.誘變育種種(1)使誘導型變?yōu)闉榻M成型———選育組成型型突變株(2)使阻遏遏型變?yōu)槿プ枳瓒粜瓦x育營養(yǎng)缺陷陷型突變株解除反饋阻遏遏選育結構類似似物抗性突變變株解除分解代謝謝物阻遏———選育抗分解解代謝阻遏突突變株2.基因工程育種種（二）.通過條件控控制提高酶產(chǎn)產(chǎn)量（1）添加誘誘導物選擇適宜的誘誘導物及濃度度:誘導物：酶酶的作用底物物酶作用底物的的前體酶的反應產(chǎn)物物酶的底物類似似物或底物修修飾物等IPTG/乳乳糖纖纖維素素/纖維二糖糖誘導纖維素素酶（2）降低阻阻遏物濃度避免使用過于于豐富的培養(yǎng)養(yǎng)基和易被利利用的碳源，，并設法阻止止效應物的形形成和濃度的的增加。流加和連續(xù)培培養(yǎng)（3）.其他促進分泌：添添加表面活性性劑離子型對對細胞有有毒害作用表面活性劑Tween－－80非離子型TritonX－100非離子型增加加細胞通性，添加產(chǎn)酶促進進劑植酸鈣鎂，聚聚乙烯醇等第四節(jié)酶酶發(fā)酵動動力學細胞生長速度度產(chǎn)物生成速度度基質(zhì)消耗速度度環(huán)境因素的影影響細胞生長動力力學發(fā)酵產(chǎn)酶動力力學發(fā)酵動力學研研究內(nèi)容：一、酶生物合合成的模式微生物細胞的的生長歷程按細胞生長和和酶產(chǎn)生的關關系，酶生物物合成具有下下列四種模式式：1、同步合成成型2、延續(xù)合成成型3、中期合成成型4、滯后合成成型1.生長偶偶聯(lián)型（又稱稱同步合成型型）酶的生物合成成與細胞生長長同步。特點：酶的合成可以以誘導，但不不受分解代謝謝物阻遏和反反應產(chǎn)物阻遏遏。當去除誘導物物、細胞進入入平衡期后，，酶的合成立立即停止，表表明這類酶所所對應的mRNA很不穩(wěn)穩(wěn)定。2.生長偶聯(lián)型中中的特殊形式式——中期合合成型酶的合成在細細胞生長一段段時間后才開開始，而在細細胞生長進入入平衡期以后后，酶的合成成也隨著停止止。特點：酶的合成受產(chǎn)產(chǎn)物的反饋阻阻遏或分解代代謝物阻遏。。所對應的mRNA是不穩(wěn)穩(wěn)定的?？莶輻U菌堿性性磷酸酶合成成曲線3.部分生長偶偶聯(lián)型（又稱稱延續(xù)合成型型）酶的合成在細細胞的生長階階段開始，在在細胞生長進進入平衡期后后，酶還可以以延續(xù)合成較較長一段時間間。特點：可受誘導，一一般不受分解解代謝物和產(chǎn)產(chǎn)物阻遏。所對應的mRNA相當穩(wěn)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳乳糖醛酸酶合合成曲線4.非生長偶偶聯(lián)型（又稱稱滯后合成型型）只有當細胞生生長進入平衡衡期以后，酶酶才開始合成成并大量積累累。許多水解解酶的生物合合成都屬于這這一類型。特點：受分解代謝謝物的阻遏作作用。所對應的mRNA穩(wěn)定性性高。黑曲霉酸性蛋蛋白酶合成曲曲線總結：影響酶生物合合成模式的主主要因素1）mRNA的穩(wěn)定性2）培養(yǎng)基中中阻遏物的存存在mRNA的穩(wěn)穩(wěn)定性，培養(yǎng)養(yǎng)基中誘導物物，反饋阻遏遏物，分解代代謝物的存在在是影響酶生生物合成模型型的主要因素素。mRNA穩(wěn)定定性代代謝調(diào)調(diào)節(jié)產(chǎn)產(chǎn)物生成成模型同步合成型(-)誘誘導dP/dt=α·dX/dt延續(xù)合成型(+)誘誘導dP/dt=α·dX/dt＋ββ·X中期合成型(-)反反饋阻阻遏dP/dt=α·dX/dt（解除阻遏后后）滯后合成型(+)分分解代謝謝物阻遏dP/dt=β·X酶生產(chǎn)中最理理想的合成模模式：延續(xù)合成型（（部分偶聯(lián)））：發(fā)酵過程中沒沒有生長期和和產(chǎn)酶期的明明顯差別。細細胞開始生長長就有酶的產(chǎn)產(chǎn)生，直至細細胞生長進入入平衡期后，，酶還可以繼繼續(xù)生成一段段時間。對于：同步合成型：：提高對應的mRNA的穩(wěn)穩(wěn)定性，如降降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：：盡量減少甚至至解除分解代代謝物阻遏，，使酶的合成提早早開始。中期合成型：：要在提高mRNA穩(wěn)定性性以及解除阻阻遏兩方面努力。目的：提高產(chǎn)產(chǎn)酶率和縮短短發(fā)酵周期最理想的合成成模式：延續(xù)續(xù)合成型策略措施：①菌種選育：：提高mRNA的穩(wěn)定性性，解除分解解代謝物阻遏遏和反饋阻遏遏。②發(fā)酵代謝調(diào)調(diào)節(jié)：理想誘誘導物的添加加，解除反饋饋阻遏和分解解代謝物阻遏遏（難利用的的碳氮源的使使用，補料發(fā)發(fā)酵）。③降低產(chǎn)酶溫溫度。二、細胞生長長動力學微生物細胞生生長的動力學學方程：Monod方方程：S－限制性基基質(zhì)濃度；μm—最大比生長長速率；Ks—Monod常數(shù)倒數(shù)形式：三、產(chǎn)酶動力力學產(chǎn)酶動力學方方程：X——細胞濃濃度，以每升升發(fā)酵液所含含的干細胞重重量表示（gDC/L））固定化微生物物細胞發(fā)酵產(chǎn)產(chǎn)酶一、固定化細細胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的特點1、提高產(chǎn)酶酶率2、可以反復復使用或連續(xù)續(xù)使用較長時時間3、基因工程程菌的質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定，不易丟丟失4、發(fā)酵穩(wěn)定定性好5、縮短發(fā)酵酵周期，提高高設備利用率率6、產(chǎn)品容易易分離純化7、適用于胞胞外酶等胞外外產(chǎn)物的生產(chǎn)產(chǎn)第三章酶酶的生產(chǎn)和制制備第五節(jié)酶酶的分離純化化（酶的制備備）酶的提取和分分離純化：將酶從細胞或或培養(yǎng)基中抽抽提出來，獲獲得與使用目目的相適應的的有一定純度度和濃度的酶酶產(chǎn)品的過程程。兩個基本環(huán)節(jié)節(jié)：分離和純純化分離：將酶從從原料中抽提提出來，并盡盡可能少引入入雜質(zhì)，得到到粗酶液純化：將酶和和雜質(zhì)中分離離開來，或者者有選擇地將將酶從包含雜雜質(zhì)中分離出出來，得到一一定純度的酶酶。酶的純化過程程與一般蛋白白質(zhì)純化過程程相比的特點點：1、特定的一一種酶在細胞胞中的含量較較少，2、酶可以通通過測定活力力的方法加以以跟蹤。前者給純化帶帶來了困難，，而后者卻迅迅速找出純化化過程的關鍵鍵所在。理想的提取和和分離純化方方法：在提高酶的的比活的同時時，要求酶回回收率高，提提取步驟少、、工藝簡單，，成本低一、原原則1.防防止酶酶失活活這一原原則要要貫穿穿純化化工作作的始始終，，在后后期尤尤為重重要。。建建立一一個可可靠和和快速速、易易行的的測定定酶活活方法法物理因因素、、化學學因素素和生生物因因素導導致酶酶失活活2.分分離純純化的的環(huán)節(jié)節(jié)的選選擇（（經(jīng)濟濟、宜宜行））：純化倍倍數(shù)、、酶活活回收收率和和重現(xiàn)現(xiàn)性（（衡量量優(yōu)劣劣）經(jīng)濟、、可靠靠，建建立靈靈敏、、快速速、特特異、、精確確的檢檢測（（酶活活和蛋蛋白質(zhì)質(zhì)的含含量））手段段。3、分分離步步驟、、方法法和成成本間間的關關系提取、、分離離、純純化、、制劑劑策略：：①酶產(chǎn)產(chǎn)品的的質(zhì)量量要求求設定目目標：：（用用途：：醫(yī)用用、食食品級級、工工業(yè)級級或研研究級級）目標酶酶蛋白白與主主要雜雜質(zhì)的的性質(zhì)質(zhì)②提取取過程程的設設計應應盡可可能防防止酶酶的損損失，，減少少處理理步驟驟。③提取取方法法的經(jīng)經(jīng)濟性性和可可分析析性盡量減減少添添加劑劑的使使用盡早使使用高高效分分離方方法，，將昂昂貴、、費時時的分分離方方法放放在最最后階階段。。酶活力力、蛋蛋白濃濃度、、純度度測定定方法法可行行性④劑型型（液液體濃濃縮酶酶、粉粉狀酶酶、精精制酶酶、結結晶酶酶等））二、酶活力力（一））酶酶活力力酶活力力activity：酶催化化一定定化學學反應應的能能力。。用酶酶催化化的反反應速速度來來表示示酶活活力，，即用用單位位時間間內(nèi)，，單位位體積積中底底物的的減少少量或或產(chǎn)物物增加加量來來表示示。轉換頻頻率：：單位時時間轉轉化的的底物物分子子數(shù)。。Kcat,單位位1/s（二））酶活活力單單位及及比活活力酶活力力單位位U（activeunit）：是是根據(jù)據(jù)某種種酶在在最適適條件件下，，單位位時間間內(nèi)被被酶作作用的的底物物的減減少量量或產(chǎn)產(chǎn)物的的生成成量來來規(guī)定定的，，表示示酶活活力高高低。。IU：：umol/minKat：mol/s1Kat=6×107IU酶的比比活力力指每mg酶蛋白白（或或每mg蛋白氨氨）所所含的的酶活活力單單位數(shù)數(shù)即：：比活活力=活力單單位數(shù)數(shù)/酶蛋白白（氮氮）mg表示酶酶制劑劑的純純度，，比活活力愈愈高，，酶愈愈純。。一、基基本過過程（一））、材料（（選擇擇）預預處理理及破破碎細細胞1.胞胞內(nèi)酶酶和胞胞外酶酶2.破破碎細細胞（二））、固液分分離（（離心或或過濾濾）酶的溶溶解性性、穩(wěn)穩(wěn)定性性第六節(jié)節(jié)酶酶分離離純化化的基基本過過程（三））、凈化與與脫色色絮凝劑劑脫脫色色處理理（四））、濃縮（熱量量法、、沉淀淀分離離、膜膜分離離）（五））純化、、結晶晶（干燥燥）二、酶酶分離離純化化方法法三、酶酶分離離純化化中的的一些些數(shù)據(jù)據(jù)（p93）1.總總蛋白白2.總總活力力3.比比活力力4.酶酶濃度度5.純純化倍倍數(shù)（（提純純倍數(shù)數(shù)）6.產(chǎn)產(chǎn)率（（回收收率））第六節(jié)節(jié)酶酶制制劑一、定定義及及分類類1定義義：從從生物物中提提取的的具有有生物物催化化能力力的酶酶，輔輔以其其他成成分，，用于于加速速加工工過程程和提提高產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量的的產(chǎn)品品。2.分分類（1））形態(tài)態(tài)上分分:固固體體液液體體（2））用途途：工工業(yè)酶酶制劑劑、飼飼料酶酶制劑劑、食食品酶酶制劑劑、醫(yī)醫(yī)藥酶酶制劑劑和洗洗滌酶酶制劑劑（3））組成成：單單一酶酶制劑劑和復復合酶酶制劑劑（4））含量量：普普通酶酶制劑劑和濃濃縮酶酶制劑劑（5））來源源：（6））生產(chǎn)產(chǎn)加工工方法法：游游離酶酶制劑劑、固固定化化酶制制劑、、酶試試紙、、