2簡述第二代測序技術(shù)的原理和應(yīng)用。第二代測序技術(shù)即焦磷酸測序技術(shù)，該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。其原理為：第1步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)；第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)；第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比；第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。第5步：加入另一種dNTP，使第2－4步反應(yīng)重復(fù)進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。簡述乳糖操縱元的基本調(diào)控方式。正調(diào)控和負調(diào)控是原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的兩種主要方式，大腸桿菌體內(nèi)存在多種操縱子，各種操縱子都是通過正調(diào)控因子和負調(diào)控因子進行復(fù)合調(diào)控，如大腸桿菌的乳糖操縱子是在阻遏蛋白的負性調(diào)控和代謝物基因激活蛋白CAP的正性調(diào)控下進行的：阻遏蛋白的負性調(diào)控：乳糖操縱子有三個結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A，分別編碼β-半乳糖苷酶、透酶、β-半乳糖苷乙?；?，結(jié)構(gòu)基因上游有一個啟動子和一個操縱元件。在啟動子上游有一個CAP結(jié)合位點。啟動子、操縱元件、CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成了乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)。I基因是調(diào)節(jié)基因，編碼阻遏蛋白。阻遏蛋白以四聚體形式與操縱元件結(jié)合，從而抑制RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合，最終抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。但偶有阻遏蛋白與操縱元件解聚，使得每個細胞中會有很少的β-半乳糖苷酶和透酶產(chǎn)生，即本底表達。當(dāng)有乳糖存在時，乳糖經(jīng)透酶進入細胞，在β-半乳糖苷酶是催化下生成半乳糖，半乳糖作為誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合繼而解除其對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。2）代謝物基因激活蛋白CAP的正性調(diào)控：由于乳糖操縱子的lac啟動子是弱啟動子，RNA聚合酶與其結(jié)合的能力較弱，只有CAP結(jié)合到啟動子上游的CAP結(jié)合位點后，促進RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，從而有效激活轉(zhuǎn)錄，該過程即為CAP對乳糖操縱子的正性調(diào)控作用。正、負調(diào)控的相對性：由于大腸桿菌存在兩種調(diào)控機制，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始由阻遏蛋白和CAP共同作用產(chǎn)生，二者因葡萄糖和乳糖的存在與否發(fā)生如下幾個方面的相對性調(diào)控：葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在解除了阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的抑制作用。葡萄糖的存在使細胞內(nèi)cAMP水平降低，cAMP-CAP復(fù)合物不能形成而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄不能進行，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖存在、乳糖不存在：無誘導(dǎo)劑存在，阻遏蛋白與DNA結(jié)合阻遏基因轉(zhuǎn)錄。同時，由于葡萄糖的存在，CAP也不能發(fā)揮正調(diào)控作用，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖和乳糖都不存在：雖然沒有葡萄糖的存在時CAP發(fā)揮正調(diào)控作用，但由于無誘導(dǎo)劑的存在，阻遏蛋白的負調(diào)控作用依然是基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖不存在、乳糖存在：此時CAP發(fā)揮正調(diào)控作用，同時由于誘導(dǎo)劑的存在，阻遏蛋白失去負調(diào)控作用，基因被打開，啟動轉(zhuǎn)錄。16.簡述原核生物基因轉(zhuǎn)錄過程并舉例說明抗生素的原理。原核生物基因轉(zhuǎn)錄過程包括：模板識別，轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止四個過程。模板識別階段：RNA聚合酶與啟動子相互作用，使啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡；轉(zhuǎn)錄起始：轉(zhuǎn)錄泡促使底物dNTP與模板DNA的堿基配對，合成RNA鏈上的核苷酸；轉(zhuǎn)錄延伸：當(dāng)合成了的RNA鏈上的9個核苷酸時，RNA聚合酶離開啟動子沿著DNA鏈移動并使新生的RNA鏈不斷延伸；轉(zhuǎn)錄終止：當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，RNA聚合酶和RNA鏈都從模板上釋放出來而終止轉(zhuǎn)錄?？股刈饔迷恚阂种萍毎诘男纬?，如青霉素，主要是抑制細胞壁中肽聚糖的合成。多氧霉素（一種效果很好的殺真菌劑）主要作用是抑制真攻細胞壁中幾丁質(zhì)的合成；影響細胞膜的功能，如多粘菌至少與細胞結(jié)合，作用于脂多糖、脂蛋白，因此對革蘭氏陰性菌有較強的殺菌作用，制霉菌素與真菌細胞膜中的類固醇結(jié)合，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)；干擾蛋白質(zhì)的合成，通過抑制蛋白質(zhì)生物合成抑制微生物生長的抗生素較多，如卡那霉素、鏈霉素等；阻礙核酸的合成，主要通過抑制DNA或RNA的合成，抑制微生物的生長，例如利福霉素、博萊霉素等。17,簡述蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控。自體調(diào)控與組蛋白密碼不是一個概念翻譯過程中的自體調(diào)控。1.阻抑蛋白對翻譯起始的調(diào)控。阻抑蛋白通過與mRNA的特定區(qū)域結(jié)合，抑制核糖體對翻譯起始區(qū)的識別。這種調(diào)控最常見的形式是，調(diào)控蛋白與含有起始密碼子AUG的序列直接結(jié)合，從而阻止核糖體的結(jié)合。2.mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯的調(diào)控。翻譯一個順反子需要二級結(jié)構(gòu)的改變，而這種二級結(jié)構(gòu)的改變又依賴于前一個順反子的翻譯。第一個順反子的翻譯破壞原有的二級結(jié)構(gòu)，使核糖體能夠與下一個順反子的翻譯起始區(qū)域結(jié)合。3.基因表達裝置蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控。一種蛋白質(zhì)或RNA調(diào)控其自身的表達，即為自體調(diào)控。細菌編碼核糖體蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)合成因子和RNA聚合酶亞基等蛋白質(zhì)的基因混合組成幾個操縱子。每個操縱子都含有數(shù)個基因。這些操縱子的表達都受操縱子自身的一些基因產(chǎn)物的調(diào)控。操縱子自身編碼的蛋白質(zhì)的富集會抑制其自身及一些相關(guān)基因產(chǎn)物的進一步合成。12簡述TAP-MS技術(shù)原理及應(yīng)用。（本題不參與考試，感興趣的可以看下）串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandemafinitypurification，TAP)是近年來發(fā)展的一種能夠快速研究生理條件下蛋白質(zhì)相互作用、揭示蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用網(wǎng)絡(luò)的新技術(shù)，如今已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一個被廣泛采納的工具。此技術(shù)使用特別設(shè)計的純化標(biāo)簽在非常接近于生理條件的情況下，能捕捉出特定的蛋白質(zhì)及其作用伙伴，借助于質(zhì)譜分析技術(shù)，研究人員即可鑒別出這種蛋白質(zhì)相互作用組。標(biāo)簽共分3部分：蛋白A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽(calmodulinbindingpeptide。CBP)和中間連接的煙草病毒(TEV)蛋白酶識別的酶切位點。

帶有TAP標(biāo)簽的融合蛋白在細胞中表達，且與內(nèi)源相互作用蛋白形成復(fù)合物，細胞裂解后經(jīng)IsG偶聯(lián)的層析柱純化，蛋白A與IgG特異結(jié)合，從而使含有標(biāo)簽的復(fù)合物得到第一次純化。為除去與柱填料非特異結(jié)合的蛋白，用TEv酶切割分離蛋白A標(biāo)簽，使含有靶蛋白的復(fù)合物與層析柱分離，并經(jīng)過鈣調(diào)素偶聯(lián)的親和層析柱進行第二次純化，靶蛋白上的CBP標(biāo)簽可與鈣調(diào)素結(jié)合；在加入過量螯合劑后CBP與親和層析柱分離使含有靶蛋白的復(fù)合體得到分離純化，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)，復(fù)合物中的各個蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，即可通過質(zhì)譜鑒定復(fù)合物中各個蛋白的氨基酸序列。該方法的優(yōu)點：(1)不需要過多的背景知識就可以得到大量含靶蛋白的復(fù)合體。(2)蛋白表達及與復(fù)合物的結(jié)合都接近生理水平。是一種檢測體內(nèi)蛋白相互作用的方法。(3)TAP采用兩步親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性。Omics是一個相對較大的概念，指從整體