會(huì)計(jì)學(xué)1DNA連接與轉(zhuǎn)化原理1、ＤＮＡ分子的體外連接

ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下，由ＤＮＡ連接酶催化兩個(gè)雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過(guò)程，ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的。第1頁(yè)/共23頁(yè)連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題：1.ＤＮＡ連接酶常用的ＤＮＡ連接酶有兩種：

(1)來(lái)自大腸桿菌的ＤＮＡ連接酶(2)來(lái)自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ連接酶。二者的作用機(jī)理類(lèi)似。第2頁(yè)/共23頁(yè)Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機(jī)制Ｔ４連接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ連接酶與輔助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ復(fù)合物。２．酶－ＡＭＰ復(fù)合物結(jié)合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來(lái).第3頁(yè)/共23頁(yè)2.連接反應(yīng)的溫度ＤＮＡ連接酶的最適反應(yīng)溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過(guò)夜。第4頁(yè)/共23頁(yè)3.DNA的平未端和粘性末端由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平未端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的，第5頁(yè)/共23頁(yè)4.堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會(huì)出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問(wèn)題，為此通常選擇對(duì)質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過(guò)接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。見(jiàn)下圖。第6頁(yè)/共23頁(yè)5.連接反應(yīng)的檢測(cè)連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測(cè)要通過(guò)下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)確定。我們下面的實(shí)驗(yàn)從粘性末端為例操作。第7頁(yè)/共23頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)試劑１．純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。２．１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫芐糖醇500μl/mlBSA３．Ｔ４ＤＮＡ連接酶４．5mMATP第8頁(yè)/共23頁(yè)三．實(shí)驗(yàn)方法

ＤＮＡ分子的體外連接１．在無(wú)菌Eppendorf管中加入以下溶液：a.0.1μg質(zhì)粒載體，２倍分子的外源ＤＮＡ。b.加無(wú)菌水至7.5μl，于４５℃加溫５分鐘使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。c.加入：１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer1μlＴ４ＤＮＡ連接酶0.1Weiss5mMATP1μl２．蓋上管蓋，充分混勻，臺(tái)式離心扣上離心５秒。３．１２℃下過(guò)夜連接反應(yīng)。４．反應(yīng)結(jié)束后于－２０℃保存。第9頁(yè)/共23頁(yè)四．結(jié)果與分析

電泳檢查連接結(jié)果１．如何判斷連接效果的成功性？第10頁(yè)/共23頁(yè)問(wèn)題與討論：１．簡(jiǎn)述Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機(jī)理。２．簡(jiǎn)述一個(gè)完整外源ＤＮＡ的克隆過(guò)程。３．連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問(wèn)題及如何提高連接效率。第11頁(yè)/共23頁(yè)2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘绑w外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù)，可獲得含重組的陽(yáng)性克隆。在此陽(yáng)性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴(kuò)增，繁殖，保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴(kuò)增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽(yáng)性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。第12頁(yè)/共23頁(yè)本實(shí)驗(yàn)由二個(gè)方面組成:1.質(zhì)粒ＤＮＡ轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)，通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)１０５－１０７轉(zhuǎn)化子/μgDNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。第13頁(yè)/共23頁(yè)所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說(shuō)法很多，目前主要有兩種假說(shuō)：１．局部原生質(zhì)體化假說(shuō)－－感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受ＤＮＡ的酶位點(diǎn)，使ＤＮＡ分子能進(jìn)入細(xì)胞。第14頁(yè)/共23頁(yè)制備感受態(tài)細(xì)胞現(xiàn)在制備感受態(tài)細(xì)胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來(lái)ＤＮＡ分子相混合.ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；４．表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。第15頁(yè)/共23頁(yè)2.重組子的篩選這和受體菌：質(zhì)粒ＤＮＡ的選擇相關(guān)，原則上要注意：１．受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；２．根據(jù)質(zhì)粒基因型和受體菌基因型互補(bǔ)原則而定。重組子的篩選方法常用的有兩種方法：第16頁(yè)/共23頁(yè)１．抗生素篩選法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。本實(shí)驗(yàn)利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子。第17頁(yè)/共23頁(yè)２互補(bǔ)法現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)。這個(gè)偏碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。受體菌則含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達(dá)，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。通過(guò)顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。第18頁(yè)/共23頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)試劑

ＬＢ培養(yǎng)基質(zhì)粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受體菌CaCl20.1MAmp第19頁(yè)/共23頁(yè)三．實(shí)驗(yàn)方法一、感受態(tài)細(xì)胞制備１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，３７℃培養(yǎng)１６～２０小時(shí)。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入２０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基錐瓶中，３７℃振蕩過(guò)夜。３．從中?。玻恚炀恨D(zhuǎn)入５０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基中３７℃振蕩培養(yǎng)４－５小時(shí)，測(cè)ＯＤ１００達(dá)０．４～０．５。４．培養(yǎng)物于冰上１０分鐘。５．轉(zhuǎn)入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。６．棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上１０分鐘。７．4,000rpm4℃離心１０分鐘，棄上清。８．加入2ml，0.1MCaCl2懸浮細(xì)胞，于４℃過(guò)夜。第20頁(yè)/共23頁(yè)二、轉(zhuǎn)化

１．在1.5mlEppendorf管中加入２００μl感受態(tài)細(xì)胞和１０μl40ngDNA溶液，溫和混勻，于冰上３０分鐘。２．于４２℃水?。梗懊?。３．冰浴２分鐘。４．加入８００μlＬＢ液體培養(yǎng)基３７℃４５分鐘。５．取２００