T-SPOT.TB實驗操作流程樣本要求：1、肝素抗凝采血管采集全血樣本（無需空腹）2、血量要求：①一般患者5-8ml②免疫力低下患者8-10ml③2歲以下兒童2-3ml3、室溫（18-25℃）保存與運輸，不得冷凍與冷藏4、近期有輸血或做過PET-CT的患者，建議兩周后再送檢5、運輸過程中防止顛簸，避免樣本溶血，溶血樣本不能進行檢測6、送檢時間：無延長試劑（T-CellXtend）：4小時內送檢，8小時內完成細胞分離有延長試劑（T-CellXtend）：4小時內送檢，32小時內完成細胞分離準備工作1、配套試劑無菌確認：RPMI-1640培養(yǎng)基AIM-V培養(yǎng)基3）淋巴細胞分離液正常為清澈、透明、無漏液（出現(xiàn)渾濁，有異物，漏液情況的，應停止使用）2、設備準備：1）使用消毒液擦拭生物安全柜并紫外滅菌30min以上2）確認培養(yǎng)箱運行在37℃、5%CO濃度條件，并確保水盤中有足夠的水，防止培養(yǎng)過程中干板3）使用消毒液擦拭所需移液器，確保移液器表面及腔體無菌3、耗材準備：1）無菌15ml錐底離心管（3-4支/人份）2）無菌吸管（2-3支/人份）無菌加樣槍頭（10同、100同、1ml若干）4）無菌1.5ml離心管（1-2支/人份）5）無菌50ml離心管（1-2支）（用于實驗中分裝1640培養(yǎng)基，降低污染風險）6）實驗中會用到的其他耗材及工具等4、加延長試劑（T-CellXtend（在實驗開始前，已超過8小時的樣本需加延長試劑）1）按25同/ml的量加入延長試劑（5ml樣本需加入125間延長試劑）2）蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻8-10次（充分混勻并避免溶血）3）室溫（18-25°C）靜置10-25min后開始實驗實驗操作流程及注意事項第一天（要求全程在II級生物安全柜中操作）一、PBMCs（外周血單個核細胞）提取1、將全血樣本轉移至15ml離心管中，加1640培養(yǎng)基稀釋至10ml（實驗中1640培養(yǎng)基需用無菌50ml離心管分裝使用，防污染）2、在另一15ml離心管中加入3-4ml淋巴細胞分離液3、將稀釋好的血液樣本緩慢加入到分離液上層（緩慢加入，不要破壞分離液液面）4、使用18℃,1000g條件離422min（建議使用緩慢降速檔，以獲取更好的分離效果）5、分離后，使用無菌吸管將分離得到的PBMCs層吸至另一無菌15ml離心管中（不能吸到底層的血細胞）二、細胞洗滌:1、將收集得到的PBMCs細胞懸液加1640培養(yǎng)基至10ml,顛倒混勻2、使用18℃，600g條件離47min3、棄上清，使用移液器將沉淀細胞吹打混勻，加1640培養(yǎng)基至10ml，顛倒混勻（細胞吹打需使用移液器充分吹打混勻，才能達到細胞洗滌目的）4、使用18℃，350g條件離47min5、棄上清（上清液需要盡量棄徹底）6、加入500同的AIM-V培養(yǎng)基，使用移液器充分吹打混勻（實驗中AIM-V培養(yǎng)基需用無菌15ml離心管分裝使用，防污染）三、細胞計數(shù)細胞計數(shù)儀計數(shù)：吸取小于100ul的細胞懸液至1.5ml離心管，上機計數(shù)，記錄“淋巴細胞+單核細胞和值”（如上樣量需要大于100ul,可用1640培養(yǎng)基稀釋1倍，再上機計數(shù)，計數(shù)結果相應乘以2）顯微鏡計數(shù)：1、先加入40同1640培養(yǎng)基至1.5ml離心管底部，再加入10間細胞懸液充分混勻，進行5倍稀釋2、取5倍稀釋后的細胞懸液10間充池血球計數(shù)板，計數(shù)四個白細胞計數(shù)區(qū)域之一（四個區(qū)域的任一個）的白細胞數(shù)，記錄計數(shù)結果

計數(shù)區(qū)域示例圖四、加樣（取相應樣本數(shù)的板條，編號并標注各抗原孔位置）OOOOOC9OCO。C）。CO。。。UO板條示例圖1、加抗原1）所有對應樣本的空白對照孔中3）加入50同AIM-V培養(yǎng)基2）所有對應樣本的抗原A孔中加入50間抗原A3）所有對應樣本的抗原B孔中加入50間抗原B4）所有對應樣本的陽性質控對照孔中》）加入50間陽性質控品2、加樣（不同的計數(shù)方法，參照其對應的加樣表）細胞計數(shù)儀計數(shù)參照“附件一：細胞計數(shù)儀計數(shù)，加樣表”，在對應編號的板孔中加入相應的細胞懸液量及AIM-V培養(yǎng)基的量（既保證每個板孔中有25萬個PBMCs,又保證150間的總體系，防止培養(yǎng)干板）（加樣順序為N到P,懸空加，防止陽性質控品污染其他板孔）顯微鏡計數(shù)參照“附件二：顯微鏡計數(shù)，加樣表”，在對應編號的板孔中加入相應的細胞懸液量及AIM-V培養(yǎng)基的量（既保證每個板孔中有25萬個PBMCs,又保證150間的總體系，防止培養(yǎng)干板）（加樣順序為N到P,懸空加，防止陽性質控品污染其他板孔）五、過夜培養(yǎng)：將加樣完成的培養(yǎng)板蓋好后，放入37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h（要求培養(yǎng)箱中有足夠的濕度，避免干板，請確保培養(yǎng)箱水盤中有足夠的水）第二天（洗板、顯色、結果判讀）一、配制酶標二抗工作液（須當天新鮮配制）1、取（n+1）X200同的1XPBS至無菌離心管中（n表示樣本數(shù)）（1XPBS要求：1、不能含有表面活性劑2、PH值嚴格要求在7.0-7.5之間），以下1XPBS要求相同）2、取（n+1）同酶標二抗原液至上一步的1XPBS中，并充分混勻二、第一次洗板（洗去細胞及非特異結合）：從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，棄細胞液，用1XPBS洗板四次每次每孔加入200同的1XPBS,放置30秒，倒棄，使用濾紙拍干三、加酶標二抗孵育：每孔加入50間新鮮配制的酶標二抗工作液，在2-8℃條件下孵育1h。四、第二次洗板：取出培養(yǎng)板，倒棄酶標二抗，用1XPBS洗板四次每次每孔加入200同的1XPBS,放置30秒，倒棄，使用濾紙拍干5五、顯色:每孔加入50間底物顯色液，室溫避光顯色7min六、終止顯色：1、蒸餾水或自來水洗板6-10次，終止顯色，并使用濾紙拍干2、重復前一步操作，共進行兩次洗滌并拍干七、烘干使用55℃的烘箱干燥5-10分鐘，讀取斑點數(shù)判讀結果結果判讀：根據(jù)抗原A孔或抗原B孔的斑點數(shù)判讀結果：1、當空白對照孔斑點數(shù)為0?5個時：（抗原A孔或抗原B孔斑點數(shù)）減去（空白對照孔斑點數(shù)）三6,為“陽性”2、當空白對照孔斑點數(shù)為6?10個時：（抗原A孔或抗原B孔斑點數(shù)）三2X（空白對照孔斑點數(shù)），為“陽性”3、如不符合上述標準，且陽性質控對照孔正常時檢測結果為“陰性”結果解釋：陰性結果：提示該樣本中未檢測出針對結核分枝桿菌特異的效應T淋巴細胞陽性結果：提示該樣本中檢測出針對結核分枝桿菌特異的效應T淋巴細胞附件一：細胞計數(shù)儀計數(shù)，加樣表WBC濃度WBC懸液AIM-V(109/L)（川）（川）212502.111902.211402.310902.410402.510002.69642.79372.889112.98614383173.181193.278223.376243.474263.571293.669313.768323.866343.96436463384.161394.260404.358424.457434.556444.654464.753474.852484.95149WBC濃度WBC懸液AIM-V(109/L)（川）（川）550505.149515.248525.347535.446545.545555.645555.744565.843575.94258642586.141596.240606.340606.439616.538626.638626.737636.837636.93664736647.135657.235657.334667.434667.533677.633677.732687.832687.93268WBC濃度WBC懸液AIM-V(109/L)（川）（川）831698.131698.230708.330708.430708.529718.629718.729718.828728.92872928729.127739.227739.327739.427739.526749.626749.726749.826749.9257510257510.1257510.2257510.3247610.4247610.5247610.6247610.7237710.8237710.92377注：當細胞計數(shù)值大于表中的最大值時，請將15ml離心管里面的，500P1細胞懸液用AIM-V培養(yǎng)基進行適量的稀釋，重新計數(shù)操作者對實驗熟練以后，在細胞第二次洗滌結束后，可目測細胞數(shù)量的多與少，酌情多加或少加一定量的AIM-V培養(yǎng)基，使細胞計數(shù)值在“2-10”之間

附件二：顯微鏡計數(shù)，加樣表細胞數(shù)樣本量AIM_V細胞數(shù)樣本量AIM_V301670351430401250451110501000559196083176577237071297567338063388559419056449553471005050105485211045551154357120425812540601303862135376314036641453466150336715532681603169165