運動性疲勞常用生化監(jiān)測手段探究,運動生物化學(xué)論文摘要：運發(fā)動訓(xùn)練水平的提高就是一個疲憊恢復(fù)再疲憊再恢復(fù)的變化經(jīng)過。隨著當(dāng)代競技水平的不斷提高,運動負(fù)荷越來越大,適度的運動性疲憊施以合理的恢復(fù)手段能夠促進人體機能水平的不斷提高,而過度疲憊不僅對提高運動成績不利,還會造成各種運動損傷,甚至損害運發(fā)動的身體健康。因而,準(zhǔn)確判定運動性疲憊的出現(xiàn)和界定其疲憊程度,對制定科學(xué)的訓(xùn)練計劃,提高訓(xùn)練效果,避免因過度疲憊引起運動損傷,具有重要的理論和實踐意義。從唾液、血液、尿液、汗液、呼出氣體等生物樣品種類出發(fā),對當(dāng)前運動性疲憊的生化監(jiān)測方式方法進行了總結(jié)及瞻望,討論了呼出氣體活體質(zhì)譜分析方式方法在運動性疲憊監(jiān)測和研究中的應(yīng)用前景,該方式方法有望成為研究和監(jiān)測運動性疲憊的一種有效手段。本文關(guān)鍵詞語：運動性疲憊;生化監(jiān)測;呼出氣體;直接質(zhì)譜分析;Abstract：Theimprovementofathletestraininglevelisaprocessoffatigue-recovery-re-fatigue-re-recovery.Withtheconstantimprovementofthelevelofmoderncompetition,theexerciseloadisgettingbiggerandbigger.Moderateexercisefatigueandreasonablerecoverymeanscanpromotetheconstantimprovementofhumanbodyfunctionlevel.Excessivefatiguenotonlyisunfavorabletoimprovesportsperformance,butalsocausesvarioussportsinjuriesandevendamagestheathletesphysicalhealth.Therefore,itisofgreattheoreticalandpracticalsignificancetoaccuratelydeterminetheoccurrenceofexercisefatigueanddefineitsdegreeoffatigue.Ithelpstoformulatescientifictrainingplans,improvetrainingeffects,andavoidsportsinjuriescausedbyexcessivefatigue.Basedonthebiologicalsamplessuchassaliva,blood,urine,sweatandexhaledbreath,thispapersummarizesandprospectsthecurrentbiochemicalmonitoringmethodsforexercisefatigue,anddiscussestheapplicationprospectsofexhaledgasinvivomassspectrometryinthemonitoringandresearchofexercisefatigue.Thismethodisexpectedtobeaneffectivemeanstostudyandmonitorexercisefatigue.Keyword：exercisefatigue;biochemicalmonitoring;exhaledgas;directmassspectrometry;運動性疲憊是指:機體的生理經(jīng)過不能維持其機能在某一特定水平上或各器官不能維持預(yù)定的運動強度[1]。運發(fā)動競技水平的提高是訓(xùn)練導(dǎo)致適度的疲憊,并等其恢復(fù)后,人體機能狀態(tài)在新的水平上獲得適應(yīng)的結(jié)果。因而,疲憊和恢復(fù)是運發(fā)動比賽訓(xùn)練中必不可少的部分。但假如訓(xùn)練負(fù)荷過量,機體得不到及時恢復(fù),疲憊會逐步積累,當(dāng)超過機體耐受極限時,則對運發(fā)動健康造成很大傷害。因而,運動性疲憊的實時監(jiān)測對科學(xué)布置訓(xùn)練計劃,提高訓(xùn)練效果,獲得優(yōu)異成績,同時避免因過度疲憊引起運動損傷,具有重要的理論和實踐意義。根據(jù)檢測指標(biāo)的不同,當(dāng)前運動性疲憊的監(jiān)測方式方法主要分為主觀評價法、生理監(jiān)測法和生化監(jiān)測法。主觀評價方式方法是運發(fā)動根據(jù)自個的訓(xùn)練情況,填寫運動科學(xué)領(lǐng)域的問卷調(diào)查表進行測評,如(主觀疲憊評定表〕[2]、(視覺類比量表〕[3]等。主觀評價法雖具有方便、無創(chuàng)等特點,但是其評價結(jié)果受被測試者主觀影響較大,評價結(jié)果不夠客觀、準(zhǔn)確。因而,主觀評價法更多的是作為輔助監(jiān)測手段。生理監(jiān)測是一種常用的運動性疲憊監(jiān)測方式方法。研究發(fā)現(xiàn),運動性疲憊發(fā)生后,會產(chǎn)生一系列的生理變化,如腦區(qū)細(xì)胞產(chǎn)生同向電流[4]、心率跳動偏高、體重下降、血壓升高、肌肉張力下降等。因而通過對運動前后腦電圖、心電圖、體重、血壓、肌肉張力等生理指標(biāo)的變化進行監(jiān)測,可評定運發(fā)動運動狀態(tài)。常用的生理監(jiān)測方式方法有生物反應(yīng)技術(shù)法[5]、循環(huán)測力計測試法[6]、心率變異性監(jiān)測法(HRV)[6]等。采用生理監(jiān)測方式方法固然能夠提供較為客觀的檢測數(shù)據(jù),但檢測結(jié)果受多種因素干擾,個體差異大,準(zhǔn)確度有待進一步提高。生化監(jiān)測方式方法是近年來快速發(fā)展的一類運動性疲憊監(jiān)測方式方法。由于機體運動與生物體的能量代謝和物質(zhì)代謝息息相關(guān),比方三磷酸腺苷代謝、磷酸腺苷代謝、糖代謝、蛋白質(zhì)代謝、氨基酸代謝、乳酸代謝等,相應(yīng)的代謝產(chǎn)物進入各循環(huán)系統(tǒng)并排出體外。與主觀感受相比,這些代謝產(chǎn)物可直接反映運發(fā)動的生理狀況。因而,可通過檢測機體唾液、汗液、尿液、血液、呼出氣體等生物樣本中的相關(guān)代謝物,來監(jiān)測機體器官的代謝狀態(tài),進而評價運發(fā)動的疲憊程度。生化分析監(jiān)測法最大的優(yōu)點為檢測結(jié)果客觀準(zhǔn)確,并且隨著分析技術(shù)的發(fā)展,在快速檢測、無創(chuàng)檢測、現(xiàn)場檢測等方面均獲得了較好的成果,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文根據(jù)分析樣本種類,對當(dāng)前運動性疲憊的生化監(jiān)測方式方法進行了總結(jié)評述,并對將來的發(fā)展趨勢進行了瞻望分析。1、運動性疲憊監(jiān)測的唾液分析方式方法唾液中含有大量的生化分子,攜帶有豐富的生理信息,機體進行大強度運動時,唾液腺-1和-2腎上腺素能受體下降,導(dǎo)致唾液免疫球蛋白水平下降,因而唾液中免疫球蛋白水平可作為運動性疲憊監(jiān)測的一種生物標(biāo)志物[7]。當(dāng)前,唾液免疫球蛋白的監(jiān)測方式方法主要有免疫比濁法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法等三種方式方法。免疫比濁法具有快速、準(zhǔn)確度高、選擇性好、操作簡單等優(yōu)點,缺點是靈敏度不高。放射免疫法利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體,與被檢測樣品的抗原或抗體結(jié)合,構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物來進行分析。該方式方法具有靈敏度高、特異性好、精到準(zhǔn)確定量、操作簡便等優(yōu)點,但是核素有放射性和半衰期,對人體有危害,試劑盒存貨期短。因而,在體育科學(xué)研究中應(yīng)用較少。酶聯(lián)免疫吸附測定法是利用酶標(biāo)記的抗原抗體特異性反響,然后通過酶與底物發(fā)生顏色反響,根據(jù)顏色變化進行定量,具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、重復(fù)性高等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于體育科學(xué)研究。如Moreira等采用酶聯(lián)免疫吸附法研究了賽事的重要性對男子排球運發(fā)動唾液中皮質(zhì)醇和免疫球蛋白的影響[8],研究結(jié)果表示清楚,與常規(guī)比賽相比,冠軍賽期間男子排球運發(fā)動唾液中的皮質(zhì)醇濃度會升高,免疫球蛋白濃度會降低。睪酮是一種類固醇荷爾蒙,它能促進蛋白質(zhì)合成,加強肌肉氣力,促進紅細(xì)胞生長,提高血紅蛋白含量,與人的運動能力密切相關(guān),且與疲憊消除也有密切聯(lián)絡(luò)。因而,睪酮在體育科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛,是運發(fā)動機能監(jiān)測的一個重要指標(biāo)。唾液中睪酮可采用氣相色譜質(zhì)譜法分析法[9]、磁固相分離酶聯(lián)免疫測定法[10]等方式方法監(jiān)測。比方,氣相色譜質(zhì)譜法是通過對唾液樣本的睪酮進行提純、衍生化,最后進入質(zhì)譜檢測。該方式方法靈敏度高、特異性高,檢出限可達20-50pg/L[9],但分析步驟較多,耗時較長。磁性微粒分離酶聯(lián)免疫測定法是酶聯(lián)免疫系統(tǒng)與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種測定方式方法,該方式方法具有穩(wěn)定性好、特異性強、對實驗室設(shè)備要求不高,檢出限為200ng/L[10],在體育科研實踐中有較好的應(yīng)用。2、運動性疲憊監(jiān)測的汗液分析方式方法排汗是人體運動經(jīng)過中代謝的一種表現(xiàn),汗液中攜帶了豐富的機體代謝信息。測量汗液的pH值,可間接揣測運發(fā)動的脫水程度,進而評價運動性疲憊程度[11]。傳統(tǒng)汗液pH檢測方式方法為顯色法,通過化學(xué)試劑或者顯色試紙來檢測汗液pH值。這類方式方法所需汗液樣本量大,檢測速度慢,靈敏度和準(zhǔn)確度均較低?；陲@色反響機理,Curto等發(fā)展了一種pH敏感染料結(jié)合離子聚合物凝膠直接測試汗液pH值的方式方法(圖1A),該方式方法可實時監(jiān)測機體在不同狀態(tài)下,汗液pH值(4.5-8.0)的變化,具有成本低,能耗低等特點[12]。但顯色反響不可逆,且汗液進入芯片無法排出,芯片只能一次性使用。因而,Weber等用碳納米管和石墨烯修飾的電化學(xué)傳感器替代離子聚合物凝膠,增加了芯片的使用壽命[13]。汗液中乳酸是另一種重要的運動性疲憊監(jiān)測指標(biāo)。人體劇烈運動消耗大量ATP和CP,當(dāng)體內(nèi)兩種物質(zhì)含量缺乏時,短時間機體會利用乳酸系統(tǒng)介入供能,產(chǎn)生大量乳酸[14]。當(dāng)前,汗液中乳酸的檢測已實現(xiàn)實時在線監(jiān)測。比方GowersSA等人發(fā)展了一種基于3D打印的微流控芯片監(jiān)測汗液中乳酸的方式方法(圖1B),該方式方法采用微透析探針刺穿皮膚進行微滲析采樣,然后再通過電化學(xué)方式方法進行檢測[15]。該方式方法能實時監(jiān)測運動經(jīng)過中乳酸的變化情況,但對皮膚有創(chuàng)傷。為了更好地貼合皮膚,實現(xiàn)實時無創(chuàng)監(jiān)測,Imani等通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在高度柔軟聚酯片材上制備了一種可穿戴的乳酸電化學(xué)無線傳感器(圖1C),以乳酸氧化酶(LOX)和改性的普魯士藍作為催化劑進行乳酸電化學(xué)檢測[14]。圖1汗液中pH和乳酸的典型分析方式方法A.基于微流控的比色法;B.基于電化學(xué)分析的可穿戴乳酸傳感器;C.基于酶催化的可穿戴無線電化學(xué)乳酸傳感器3、運動性疲憊監(jiān)測的尿液分析方式方法運發(fā)動進行高強度運動時,會消耗體內(nèi)大量的營養(yǎng)物質(zhì),其排尿量及尿液成分會發(fā)生明顯變化。因而,通過監(jiān)測運發(fā)動運動前后尿液成分的變化,可判定運發(fā)動的疲憊程度,其主要監(jiān)測的指標(biāo)有尿蛋白、尿隱血、尿膽原、膽紅素、尿肌酐、皮質(zhì)醇、酮體等。比方機體產(chǎn)生運動性疲憊時,腎上腺素、去甲腎上腺素等分泌會增加,出現(xiàn)尿蛋白。尿蛋白的常用監(jiān)測方式方法主要有考馬斯亮藍法[16]、雙縮脲法[17]、芐乙氯銨比濁法[18]等?？捡R斯亮藍法是利用考馬斯亮藍陰離子與蛋白質(zhì)分子的NH+3基團反響后的顏色變化進行尿蛋白含量測定。該方式方法具有樣本用量少,靈敏度高、操作簡便、快速、顯色穩(wěn)定等優(yōu)點,缺點是尿液基體復(fù)雜,在用于不同蛋白質(zhì)測定時,偏差較大。雙縮脲原理是蛋白質(zhì)肽鍵在堿性溶液中與Cu2+絡(luò)合顯藍色,根據(jù)顏色的深度,計算尿蛋白的含量。該方式方法的缺乏之處是靈敏度低,檢測需樣量多。芐乙氯銨比濁法是利用芐乙氯銨在堿性條件下與蛋白構(gòu)成沉淀物,對沉淀物體系進行比濁檢測,該方式方法具有線性范圍寬、靈敏度高、精到準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好,可以用于樣品微量化監(jiān)測,檢出限為60mg/L[18]。常壓質(zhì)譜分析技術(shù)是無需樣品預(yù)處理,可對樣品進行快速分析的質(zhì)譜技術(shù)[19]。電噴霧萃取電離技術(shù)[20]和內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)[21]是兩種典型常壓質(zhì)譜技術(shù),可實現(xiàn)液態(tài)、氣態(tài)、黏稠態(tài)等多種復(fù)雜基體樣品的直接質(zhì)譜分析,具備靈敏度高、特異性好、分析速度快等優(yōu)點,在尿液、血液分析中已有廣泛應(yīng)用[22],可檢測華而不實的氨基酸、蛋白、脂質(zhì)等多種生物分子。肌酐是肌肉中肌酸代謝產(chǎn)物,在體育科學(xué)研究中是反響機體肌肉疲憊的重要標(biāo)志物,例如李雪等發(fā)展了一種結(jié)合同位素稀釋技術(shù)和萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)分析尿液中尿肌酐的方式方法(圖2),該方式方法具有靈敏度高(50g/L)、分析速度快(4分鐘/樣品)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點[23]。因而,這類直接質(zhì)譜技術(shù)在運動性疲憊的監(jiān)測中將具有重要的應(yīng)用。圖2萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)檢測尿肌酐示意圖4、運動性疲憊監(jiān)測的血液分析方式方法血液成分的監(jiān)測能夠提供豐富的機體機能變化信息,作為生物樣本已被廣泛用于運動人體科學(xué)研究。血液中常見的標(biāo)志物主要有血紅蛋白、血清睪酮、皮質(zhì)醇、血乳酸、血尿素等生化標(biāo)志物。例如,機體產(chǎn)生疲憊時,紅細(xì)胞毀壞,血紅蛋白從紅細(xì)胞中游離出,導(dǎo)致血液中血紅蛋白下降。常見的血液中血紅蛋白的檢測方式方法有電化學(xué)檢測法[24]、近紅外光譜法[25]、質(zhì)譜法[26]等。例如Xu等利用納米銀溶膠電極對血紅蛋白良好的催化活性,發(fā)展了一種血紅蛋白濃度檢測方式方法[27],該方式方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、選擇性高等優(yōu)點,線性范圍2.010-7～1.010-5mol/L,檢出限為7.410-8mol/L。近紅外光譜法利用強散射介質(zhì)對光吸收而進行血紅蛋白定量檢測[28],該方式方法的優(yōu)點是無需采集血樣、對人體無創(chuàng)傷、測量速度快、操作簡便、可實時在線監(jiān)測。缺點是精度不高、檢測部位對檢測結(jié)果影響較大。質(zhì)譜技術(shù)由于具有高的檢測靈敏度,是一種重要的血紅蛋白分析技術(shù)。但傳統(tǒng)質(zhì)譜分析方式方法通常需要較多的樣品預(yù)處理及較長的分析時間,難以知足快速分析要求。針對這些問題,宋麗麗等開發(fā)了一種內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜快速檢測血紅蛋白技術(shù)(圖3)[27],首先利用功能化的氧化石墨烯選擇性吸附血紅蛋白,然后通過內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)對吸附了血紅蛋白的石墨烯進行質(zhì)譜分析。該方式方法具有特異性好、分析速度快(約4分鐘/樣品)、樣品用量少(0.9L)等優(yōu)點。圖3內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)檢測血紅蛋白裝置示意圖5、運動性疲憊監(jiān)測的呼出氣體分析方式方法呼出氣體與心肺嚴(yán)密相連,攜帶有大量的生物分子,通過檢測人體呼出氣體,能夠獲得機體豐富的生理/病理信息。在病理分析方面,如朱騰高等采用電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)(EESI)檢測不同健康狀態(tài)的志愿者接受中醫(yī)推拿前后的呼出氣體,結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方式方法偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)區(qū)分了不同健康狀態(tài)的志愿者,并揭示了志愿者接受中醫(yī)推拿后,呼出氣體中腎上腺素含量會顯著變化,腎上腺素是機體產(chǎn)生運動性疲憊時與尿蛋白代謝相關(guān)的物質(zhì)[29]。在生理分析方面,如陳煥文等初次采用其自主開發(fā)的電噴霧萃取電離飛行時間質(zhì)譜(EESI-TOF-MS)對呼出氣體進行了實時在線活體分析(圖4A),檢測到尿素、氨基酸、葡萄糖等與運動性疲憊相關(guān)物質(zhì),華而不實尿素是傳統(tǒng)尿檢方式方法監(jiān)測運動性疲憊的常用標(biāo)志物之一,從分子水平上證明了呼出氣體與人體生理/病理狀態(tài)之間存在密切聯(lián)絡(luò)(圖4B)[20]。圖4EESI-MS技術(shù)在呼出氣體分析中的應(yīng)用A.用于呼吸氣體分析的EESI-MS典型裝置示意圖;B.采用EESI-MS檢測呼出氣體中的尿素和葡萄糖等生物分子6、總結(jié)及瞻望隨著國家對體育事業(yè)的重視以及全民運動健身的興起,實現(xiàn)運動性疲憊的監(jiān)測,對科學(xué)合理開展運動具有重要的意義。生化監(jiān)測法通過對血樣、尿樣、唾液、汗液等生物樣本中的運動性疲憊標(biāo)志物進行檢測,可有效判定運動性疲憊狀態(tài),是一種重要的運動性疲憊監(jiān)測方式方法。當(dāng)前,基于光譜分析、質(zhì)譜分析、色譜技術(shù)、電化學(xué)分析技術(shù),已開發(fā)了一系列運動性疲憊的生化監(jiān)測方式方法,并已有較好的應(yīng)用。但這些方式方法仍存在一些問題,比方在準(zhǔn)確度、靈敏度、分析速度、采樣方式等方面存在一定的缺乏,評價指標(biāo)不夠明確。將來運動性疲憊監(jiān)測方式方法將在進一步明確評價指標(biāo)的前提下,朝無創(chuàng)、高靈敏、高準(zhǔn)確、快速、實時、現(xiàn)場等方面發(fā)展。呼出氣體與心肺嚴(yán)密相連,攜帶有大量能反映人體生理/病理狀態(tài)的信息,且相對血液、尿液等生物樣本分析,呼出氣體分析具有原位、實時在線、無創(chuàng)、快速、高通量、便捷等優(yōu)點。固然,當(dāng)前呼出氣體用于運動性疲憊的研究尚未有文獻報道,但是已有文獻表示清楚采用EESI-MS質(zhì)譜技術(shù)在呼出氣體中檢測到了與運動性疲憊相關(guān)標(biāo)志物。以呼出氣體為生物樣本,采用直接質(zhì)譜技術(shù)實時在線檢測運發(fā)動運動前后呼出氣體成分,研究運發(fā)動從開場運動到力竭狀態(tài)整個經(jīng)過中呼出氣體的變化,結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方式方法如聚類分析(CA),多塊偏最小二乘分析(MB-PLS)、主成分分析(PCA)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析,尋找運動性疲憊標(biāo)志物,建立運發(fā)動運動性疲憊損傷預(yù)警模型,為指導(dǎo)運發(fā)動科學(xué)訓(xùn)練,避免過度損傷,引發(fā)運動性疲憊提供重要的理論根據(jù),這可能將是運動性疲憊監(jiān)測與研究的一個新的發(fā)展方向。以下為參考文獻[1]WehbeG,GabettT,DwyerD,etal.NeuromuscularFatigueMonitoringinTeamSportAthletesUsingaCycleErgometerTest[J].IntJSportsPhysiolPerform,2021,10(3):292-297.[2]GatsevaP,VladevaS,ChardaclievaN.SubjectiveassessmentoffatigueandstressreactioninschoolchildrenfromthemathematicalhighschoolinPazardjik[J].ActaMedicaBulgarica,2004,31(1):68-72.[3]LeungAW,ChanCC,LeeAH,etal.Visualanaloguescalecorrelatesofmusculoskeletalfatigue[J].PerceptualMotorSkills,2004,99(1):235-246.[4]KacemA,FtaitiF,ChamariK,etal.EEG-RelatedChangestoFatigueduringIntenseExerciseintheHeatinSedentaryWomen[J].Health,2020,6(11):1277-1285.[5]WindthorstP,MazurakN,KuskeM,etal.Heartratevariabilitybiofeedbacktherapyandgradedexercisetraininginmanagementofchronicfatiguesyndrome:Anexploratorypilotstudy[J].JournalofPsychosomaticResearch,2021(93):6-13.[6]ThorpeRT,AtkinsonG,DrustB,etal.MonitoringFatigueStatusinEliteTeam-SportAthletes:ImplicationsforPractice[J].IntJSportsPhysiolPerform,2021,12(Suppl2):S2-27-S2-34.[7]MatsubaraY,ShimizuK,TanimuraY,etal.EffectofacupunctureonsalivaryimmunoglobulinAafteraboutofintenseexercise[J].AcupunctureinMedicine,2018,28(1):28-32.[8]MoreiraA,FreitasCG,NakamuraFY,et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