/15型，記為5。對于BC1、DH和RI群體，每個(gè)分離的基因座都只有兩種基因型，不論是共顯性標(biāo)記還是顯性標(biāo)記，兩種基因型都可以識別，加上缺失數(shù)據(jù)的情況，總共只有3種類型。因而用3個(gè)數(shù)字就可以將標(biāo)記全部帶型數(shù)字化。在分析質(zhì)量性狀基因與遺傳標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系時(shí)，也必須將有關(guān)的表型數(shù)字化，其方法與標(biāo)記帶型的數(shù)字化相似。例如，假設(shè)在DH群體中，有一個(gè)主基因控制株高，那么就可以將株系按植株的高度分為高稈和矮稈兩大類，然后根據(jù)親本的表現(xiàn)分別給高稈和矮稈株系賦值，如1和2。將質(zhì)量性狀經(jīng)過這樣的數(shù)字化處理，就可以與DNA標(biāo)記數(shù)據(jù)放在一起進(jìn)行連鎖分析。DNA標(biāo)記數(shù)據(jù)的收集和處理應(yīng)注意以下問題：（1）應(yīng)避免利用沒有把握的數(shù)據(jù)。由于分子多態(tài)性分析涉及許多實(shí)驗(yàn)步驟，很難避免出現(xiàn)錯(cuò)誤，經(jīng)常會遇到所得試驗(yàn)結(jié)果（如X-光片）不清楚等問題。如果硬性地利用這樣沒有把握的數(shù)據(jù)，不僅會嚴(yán)重影響該標(biāo)記自身的定位，而且還會影響到其它標(biāo)記的定位。因此，應(yīng)刪除沒有把握的數(shù)據(jù)，寧可將其作為缺失數(shù)據(jù)處理，或重做試驗(yàn)。（2）應(yīng)注意親本基因型，對親本基因型的賦值（如P1型為1,P2型為2），在所有的標(biāo)記座位上必須統(tǒng)一，千萬別混淆。如果已知某兩個(gè)座位是連鎖的，而所得結(jié)果表明二者是獨(dú)立分配的，這就有可能是把親本類型弄錯(cuò)引起的。（3）當(dāng)兩親本出現(xiàn)多條帶的差異時(shí)，應(yīng)通過共分離分析鑒別這些帶是屬于同一座位還是分別屬于不同座位。如屬于不同座位，應(yīng)逐帶記錄分離數(shù)據(jù)。二、遺傳圖距與物理距離對應(yīng)關(guān)系的估計(jì)不同生物的1cM圖距所對應(yīng)的實(shí)際物理距離（堿基對數(shù)量）存在很大差異。一般而言，生物越低等或越簡單，1cM圖距平均對應(yīng)的堿基對數(shù)量就越少（表3.1）。表3.1中給出的各種生物中遺傳圖距與物理距離之間的對應(yīng)關(guān)系只是一個(gè)大約的平均值，實(shí)際上它變化很大。在一條染色體上，由于不同區(qū)域上發(fā)生交換的頻率存在差異，因而遺傳圖距與物理距離之間的對應(yīng)關(guān)系可以有很大的變化。例如，在著絲粒附近，染色體交換受到抑制，因而所估計(jì)的遺傳圖距小于平均對應(yīng)的物理距離。在同一種生物中，兩個(gè)特定基因座之間的遺傳圖距會因遺傳背景的不同而改變，甚至有時(shí)由同一對親本所產(chǎn)生的遺傳背景相同的不同群體間也存在很大差異。表3.1不同生物中單位圖距所相當(dāng)?shù)钠骄锢砭嚯x

物種基因組大?。╧b）遺傳圖距（cM）kb/cM嗜菌體T41.6X1028000.2大腸桿菌4.2X1031,7502.4酵母2.0X1044,2004.8真菌2.7X1041,00027.0線蟲8.0X104320250.0果蠅1.4X105280500.0水稻4.5X1051,500300.0小鼠3.0X1061,7001,800.0人類3.3X1063,3001,000.0玉米2.5X1062,5001,000.0三、構(gòu)建DNA標(biāo)記圖譜的計(jì)算機(jī)軟件遺傳圖譜的構(gòu)建需要對大量標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨著標(biāo)記數(shù)目的增加，計(jì)算工作量常常呈指數(shù)形式增加，這是手工無法完成的。因此，必須借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析和處理。許多學(xué)者為構(gòu)建遺傳圖譜設(shè)計(jì)了專用程序包,通過Internet網(wǎng)址/soft/list.html可以獲得各種專用程序的相關(guān)信息，如軟件的名稱及簡要介紹，源程序編碼語言、支持的操作系統(tǒng)、執(zhí)行程序的名稱、參考文獻(xiàn)以及獲取軟件的網(wǎng)址等。應(yīng)用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構(gòu)建的常用軟件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE軟件可通過/software/linkage獲得,該軟件是利用最大似然法估計(jì)兩座位或多座位間的重組率和LOD值;MAPMAKER/EXP可通過/distri-bution/software/mapmaker3獲得，該軟件可以應(yīng)用于各種類型的實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行遺傳作圖，是目前應(yīng)用最為廣泛的作圖軟件之一。第四節(jié)DNA標(biāo)記連鎖圖譜的完善一、DNA標(biāo)記連鎖群的染色體定位把分子標(biāo)記所建立的連鎖群與經(jīng)典遺傳圖譜聯(lián)系起來，并將其歸屬到相應(yīng)的染色體上，是構(gòu)建了一個(gè)比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作。通常根據(jù)分子標(biāo)記與已知染色體位置的形態(tài)標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定分子標(biāo)記連鎖群屬于哪條染色體。還可以利用非整倍體或染色體結(jié)構(gòu)變異材料，如水稻中利用三體、玉米中利用A/B易位系、小麥中利用缺體/四體染色體代換系等，將分子標(biāo)記連鎖群歸屬到相應(yīng)的染色體上。以水稻為例，目前已獲得全套12條染色體的初級三體（2n+1）。在水稻某種三體中，由于三體染色體有一式3份，其DNA含量為其它11條染色體的1.5倍。在DNA定量相當(dāng)準(zhǔn)確的條件下，用已知能檢測某一連鎖群的探針分別與12種三體的總DNA雜交。根據(jù)劑量效應(yīng)，雜交強(qiáng)弱與同源序列的含量成正比，雜交后對應(yīng)三體的DNA濾膜放射自顯影顯帶強(qiáng)度將明顯高于其它11種，由此可以判定該標(biāo)記所對應(yīng)的序列就在該三體染色體上。隨著技術(shù)的進(jìn)步，原位分子雜交的靈敏度已可以揭示單拷貝序列的雜交位點(diǎn)，因此采用原位分子雜交可以容易地將連鎖群的分子標(biāo)記定位到染色體上。要得到一個(gè)完整的遺傳圖譜，必須知道染色體上的標(biāo)記與著絲粒之間的距離。一個(gè)完整的染色體具有以下幾個(gè)主要部分：著絲粒、縊痕、隨體及端粒，這些基本結(jié)構(gòu)在生物染色體的運(yùn)動與復(fù)制等方面起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)也是遺傳圖譜制作中不可忽視的重要部分。由于著絲粒并不是一個(gè)基因，不能從表型測知，因此采用常規(guī)的兩點(diǎn)、三點(diǎn)乃至多點(diǎn)分析方法是無法確定標(biāo)記與著絲粒之間的關(guān)系的。在經(jīng)典遺傳圖譜的構(gòu)建中，一般采用近端著絲粒染色體來對基因與著絲之間的距離進(jìn)行定位。近端著絲粒染色體是正常染色體在著絲粒附近斷裂形成的異常染色體。目前已獲得小麥全部42條染色體的近端著絲粒染色體。利用染色體易位材料也可以判斷著絲粒在染色體上的位置。一般易位點(diǎn)和著絲粒所在部分的交換被抑制，因而推算位于著絲粒兩旁的易位點(diǎn)與標(biāo)記基因間的重組率時(shí)一般都偏小。利用這個(gè)現(xiàn)象可以推算連鎖圖上著絲粒的位置。在細(xì)胞學(xué)上，利用已知易位點(diǎn)的易位系統(tǒng)進(jìn)行基因分析也可知道著絲粒的位置。早在1945年，在玉米中就利用易位分析的結(jié)果推測了全部染色體的著絲粒位置。染色體上的端粒是指染色體的自然末端。在遺傳圖譜的構(gòu)建中，端粒位置的確定就意味著為染色體的全長設(shè)定界標(biāo)。傳統(tǒng)的凝膠電泳方法由于分辨能力有限，大多數(shù)情況下無法將具有多態(tài)性的端粒片段區(qū)分開來。一般要借助具有高分辨率的脈沖場凝膠電泳（PFGE）才能將有差異的端粒片段分離開來。利用PFGE與切割位點(diǎn)稀少的限制性酶相結(jié)合，Wu和Tanksley（1993）研究了水稻端粒結(jié)構(gòu)的特征，采用來自擬南芥的端粒探針，將三個(gè)水稻的端粒DNA電泳條帶分別定位在第8、9、11染色體上，并證實(shí)了多態(tài)性的端粒片段不僅在遺傳上而且在物理上與遺傳圖譜上最遠(yuǎn)端的RFLP標(biāo)記相連鎖。目前，在日本水稻基因組研究計(jì)劃所構(gòu)建的包含2275個(gè)標(biāo)記的水稻分子連鎖圖中，除第9染色體之外，其余11條染色體的著絲粒（區(qū)）都已定位（Harushimaetal.1998）。另外，該圖中的第5染色體短臂、第11染色體兩臂以及第12染色體短臂的端粒也已定位。二、飽和DNA標(biāo)記連鎖圖的制作遺傳圖譜飽和度是指單位長度染色體上已定位的標(biāo)記數(shù)或標(biāo)記在染色體上的密度。一個(gè)基本的染色體連鎖框架圖大概要求在染色體上的標(biāo)記平均間隔不大于20cM。如果構(gòu)建連鎖圖譜的目的是為了進(jìn)行主基因的定位，其平均間隔要求在10?20cM或更小。用于QTL定位的連鎖圖，其標(biāo)記的平均間隔要求在10cM以下。如果構(gòu)建的連鎖圖譜是為了進(jìn)行基因克隆，則要求目標(biāo)區(qū)域標(biāo)記的平均間隔在1cM以下。不同生物基因組大小有極大差異，因此滿足上述要求所需的標(biāo)記數(shù)是不同的。以人類和水稻為例，它們的基因組全長分別為3.3X106kb和4.5X105kb，如果構(gòu)建一個(gè)平均圖距為0.5cM的分子圖譜,則所要定位的標(biāo)記數(shù)就要分別達(dá)到6600和3000個(gè)。幾種生物不同圖譜飽和度下所需定位的標(biāo)記數(shù)如表3.2所示。表3.2遺傳圖譜達(dá)到特定飽和度所需的標(biāo)記數(shù)生物人類水稻玉米擬南芥番茄(kb)3.3X1064.5X1052.5X1067.0X1047.1X105基因組(cM)3300150025005001500大小kb/cM10003001000140473圖20cM165751252575譜10cM33015025050150飽5cM660300500100300和1cM3300150025005001500度0.5cM66003000500010003000Tanksley等(1988)以假設(shè)擁有12條染色體，每條長100cM，全長1200cM的生物為例，研究了所需標(biāo)記數(shù)與圖譜飽和度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)影響所需標(biāo)記數(shù)的主要因素有兩個(gè)。一個(gè)是標(biāo)記間的平均距離，即圖譜總長度除以定位的標(biāo)記數(shù)，它反映了標(biāo)記圖譜的平均密度。對于染色體全長1200cM的生物，如果定位了120個(gè)標(biāo)記，則標(biāo)記間的平均距離為10cM。另一個(gè)因素是標(biāo)記間的最大距離。標(biāo)記在基因組上的分布是不均勻的。即使在一張平均密度很高的圖譜上，仍然可能存在較大的間隙區(qū)。例如，據(jù)理論推算，如果用于作圖的標(biāo)記是隨機(jī)選擇的，則當(dāng)標(biāo)記平均距離為1cM時(shí)，仍有可能存在10cM的間距。而若要將最大可能間距從10cM減小到5cM，則需要另外增加1000個(gè)標(biāo)記。因此，通過提高圖譜平均密度的方法來縮小最大標(biāo)記間距是很困難的。在實(shí)際研究中，為了填補(bǔ)間隙，應(yīng)有針對性地在間隙區(qū)上尋找標(biāo)記，或?qū)ふ以撻g隙所在區(qū)域上有差異的親本構(gòu)建作圖群體。沒有一種標(biāo)記在基因組中分布是完全隨機(jī)的。如著絲粒區(qū)通常以重復(fù)序列為主，因而以單拷貝克隆為探針的RFLP標(biāo)記就不可能不覆蓋這些染色體區(qū)域。從這一點(diǎn)考慮，利用特性上互補(bǔ)的不同DNA標(biāo)記進(jìn)行遺傳作圖，將有助于提高遺傳圖譜的飽和度。三、DNA標(biāo)記連鎖圖與經(jīng)典遺傳連鎖圖的整合從1987年報(bào)道玉米和番茄的RFLP遺傳圖譜以來，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培植物幾乎都已構(gòu)建了以RFLP為主的DNA標(biāo)記遺傳圖譜，其中水稻分子圖譜上所定位的RFLP標(biāo)記數(shù)已超過2000個(gè)(Harushimaetal.1998)。為了充分利用現(xiàn)有的分子和遺傳的信息，必須將分子遺傳圖譜與經(jīng)典遺傳圖譜結(jié)合起來，成為一張綜合的遺傳圖譜。將兩類遺傳標(biāo)記綜合到一張遺傳圖譜中去，不僅是重要經(jīng)濟(jì)性狀準(zhǔn)確定位的需要，也是以圖位克隆方法分離目的基因的需要。但是，由于兩類圖譜的構(gòu)建是相互獨(dú)立的，使用的作圖群體是不同的，且它們之間缺乏共有的遺傳標(biāo)記，因而整合起來并不容易。另外，經(jīng)典遺傳圖譜本身就是一張依據(jù)許多由不同研究者利用不同作圖群體在不同條件下完成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而繪制成的綜合圖譜，其中有的標(biāo)記基因間的相對位置不一定十分精確，因此，在與分子圖譜整合時(shí)，不能簡單地根據(jù)標(biāo)記間的相對圖距進(jìn)行推論。鑒于上述原因，分子圖譜與經(jīng)典圖譜的整合只能通過將傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記基因一個(gè)一個(gè)地定位到分子圖譜中去的策略來進(jìn)行。為此，可以選擇各種傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記材料來建立作圖群體，并用適當(dāng)?shù)姆椒焖俚卣业脚c傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記緊密連鎖的分子標(biāo)記(參見第四章)，再根據(jù)分子標(biāo)記在分子圖譜上的位置來確定傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記的位置。在栽培植物中，水稻的經(jīng)典連鎖圖譜和分子連鎖圖譜的整合工作進(jìn)展較快，這主要受益于水稻在經(jīng)典連鎖圖譜上的長期累積性工作，目前至少已將47個(gè)形態(tài)標(biāo)記和11個(gè)同工酶標(biāo)記定位到了分子連鎖圖上(Causse等1994)。第五節(jié)比較作圖比較作圖(ComparativeMapping)就是利用一種物種的DNA標(biāo)記對另一物種進(jìn)行遺傳或物理作圖。比較作圖的分子基礎(chǔ)就是物種間DNA序列尤其是編碼序列的保守性。通過比較作圖可揭示不同物種基因組或基因組區(qū)域同線性或共線性的存在，從而了解不同物種基因組結(jié)構(gòu)的相似性及基因組進(jìn)化的歷程。所謂同線性是指定位在一個(gè)物種的染色體上的兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記又被定位于另一物種的同源染色體區(qū)域上，但這些標(biāo)記間的相對排列順序可變化；而共線性則指定位在同源染色體區(qū)域上的標(biāo)記，其標(biāo)記間的相對排列順序是保守的。比較作圖始于人-鼠間的基因組同源性比較。至今許多植物之間也進(jìn)行了比較作圖研究，如番茄、馬鈴薯和辣椒(Tanksleyetal.1988；1992)；水稻、小麥和玉米(Ahnetal.1993；1994)；小麥、大麥和黑麥(Devosetal.1993)；高粱和玉米(Pereiraetal.1994)；擬南芥和蕓苔屬(Kowalskietal.1994)以及大麥和水稻(Maroofetal.1996)等。Moor等(1995)對水稻、小麥、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6種主要禾本科物種的比較作圖研究表明，這些禾本科植物基因組的保守性可歸結(jié)到水稻基因組的19個(gè)連鎖區(qū)段上，由這19個(gè)區(qū)段可實(shí)現(xiàn)對所研究的全部禾谷類作物進(jìn)行染色