PCR檢測的質(zhì)量控制孫明博士

北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司隨著獸醫(yī)防疫工作重要性的逐步提高，PCR檢測技術(shù)已被獸醫(yī)工作者比較廣泛認(rèn)可，已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究走進(jìn)了臨床應(yīng)用階段。如何提高PCR檢測質(zhì)量，已成為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員不可回避的一個(gè)問題，它直接影響實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的可信度和獸醫(yī)防疫工作質(zhì)量。我們認(rèn)為，PCR檢測質(zhì)量的控制是一個(gè)系統(tǒng)工程，總體上涉及三個(gè)方面：一是試驗(yàn)儀器；二是試驗(yàn)試劑與耗材；三是人員操作。任何一個(gè)方面出現(xiàn)問題，都會影響PCR檢測質(zhì)量。一、試驗(yàn)儀器PCR儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)（紫外分析儀或手提紫外等）以及移液器都可能影響PCR檢測的質(zhì)量。PCR儀是控制PCR反應(yīng)溫度變化的，其溫度和控制時(shí)間的準(zhǔn)確程度可能會影性PCR檢測質(zhì)量。移液器取液的準(zhǔn)確程度影響反應(yīng)體系是否能達(dá)到最佳反應(yīng)環(huán)境。紫外分析系統(tǒng)對檢測敏感性有明顯的影響。紫外分析系統(tǒng)有3種類型儀器：紫外分析儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈。紫外分析儀直接用眼睛觀察瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶。紫外凝膠成像系統(tǒng)是在計(jì)算機(jī)上通過攝像系統(tǒng)對瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行觀察。手提紫外燈可以在電泳過程中直接對瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行觀察，使用方便，分辨率比較低。依據(jù)這些儀器的分辨率由高到低順序是紫外分析儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈。紫外分析儀有時(shí)能看到弱陽性擴(kuò)增帶，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上卻看不到。手提紫外燈只有在陽性擴(kuò)增帶比較亮?xí)r才能看到，建議為保證檢測質(zhì)量最好不用手提紫外燈，可用于臨時(shí)的電泳結(jié)果觀察。儀器的質(zhì)量控制應(yīng)該通過實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量認(rèn)證來實(shí)施，定期進(jìn)行儀器的效驗(yàn)。沒有質(zhì)量認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室可以定期請儀器生產(chǎn)廠家進(jìn)行效驗(yàn)和保養(yǎng)，確保所有儀器處于正常的工作狀態(tài)。二、試驗(yàn)試劑與耗材在PCR檢測質(zhì)量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實(shí)驗(yàn)人員最為關(guān)注的檢測質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽(yù)好的廠商，一但選定后最好不要輕易改換。如果必須改換時(shí)應(yīng)與原產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格比對試驗(yàn)，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗(yàn)。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說TaqDNA聚合酶，不同廠家生產(chǎn)的質(zhì)量是有差異的，盡管都是標(biāo)出相同活性單位，但其標(biāo)定方法和保存液的成分以及運(yùn)輸過程的不同常常導(dǎo)致實(shí)際活性單位是有差異的，有時(shí)由于其活性低，使得弱陽性樣品漏檢；有時(shí)由于其活性過高出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。這與ELISA檢測中酶結(jié)合物的作用相似。其實(shí)影響PCR檢測結(jié)果的試劑很多，可以這樣說，PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果。控制試劑的質(zhì)量是作好PCR檢測前提。我們認(rèn)為：最好是選擇PCR試劑盒來控制試劑質(zhì)量。評價(jià)一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩(wěn)定性、操作簡便程度外，還應(yīng)包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個(gè)PCR檢測試驗(yàn)的程度。如果試劑盒提供了整個(gè)PCR檢測試驗(yàn)的試劑，表明該試劑盒對PCR檢測試驗(yàn)的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測的試劑的質(zhì)量控制程度比較低，意味著檢測質(zhì)量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽光下長時(shí)間的照射下失效了，在紫外燈下發(fā)熒光效能降低，可能會造成一些弱陽性樣品的漏檢，出現(xiàn)假陰性。其它試劑出現(xiàn)問題也是一樣影響檢測質(zhì)量。試劑盒在生產(chǎn)過程中，有一套試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測，在有效期內(nèi)能確保每種試劑的質(zhì)量。因此，選擇試劑盒進(jìn)行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中，最好全部使用試劑盒提供試劑，對PCR檢測質(zhì)量控制有益。實(shí)驗(yàn)耗材也是影響PCR檢測質(zhì)量的因素之一。PCR反應(yīng)管薄厚以及傳導(dǎo)熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應(yīng)管蓋子不嚴(yán)密，導(dǎo)致擴(kuò)增過程中反應(yīng)液水份蒸發(fā)，嚴(yán)重影響檢測靈敏度。PCR反應(yīng)體系是微量的，移液器的Tip頭生產(chǎn)質(zhì)量不好時(shí)，有時(shí)致使液體殘留量多或洪吸作用強(qiáng)，導(dǎo)致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應(yīng)體系不準(zhǔn)，造成檢測質(zhì)量下降。在每次PCR檢測時(shí)，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時(shí)，表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。因此，每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定對照，只有設(shè)立試驗(yàn)全程的對照，才能證明試驗(yàn)結(jié)果成立。這一點(diǎn)對PCR和RT-PCR檢測試驗(yàn)是非常重要的。陽性對照在試劑盒中是必須有的組分。設(shè)立陽性對照有3種類型：第一種是用檢測的病原微生物作為陽性對照。這樣的直接對照優(yōu)點(diǎn)是直觀、準(zhǔn)確、本次試驗(yàn)完整條件對照，可以說明此次試驗(yàn)是否成立。缺點(diǎn)是對檢測過程中增加了PCR污染的指數(shù)。另外，不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立。第二種是設(shè)立一種與檢測病毒無關(guān)微生物作為陽性對照。優(yōu)點(diǎn)是降低了PCR污染的危險(xiǎn)性，并且提高了試劑盒的生物安全性。缺點(diǎn)是僅是參考陽性對照，不夠直接、完全反映本次試驗(yàn)成立，也不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立?？蛇m合怕污染的實(shí)驗(yàn)室或要求生物安全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)設(shè)立參考對照，除了陽性擴(kuò)增帶之外，又設(shè)立一條擴(kuò)增帶，指示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)檢測情況。檢測為陽性時(shí)出現(xiàn)兩條不同大小擴(kuò)增帶，陰性時(shí)出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶。這種對照設(shè)立技術(shù)要求高，成本也高些，對照效果是最理想的，可以排除每個(gè)檢測樣品操作失誤或試劑出現(xiàn)問題對檢測造成的影響。由于在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)對兩條模板同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會成為PCR對照的發(fā)展趨勢。三、人員操作我們多名實(shí)驗(yàn)室人員曾經(jīng)對相同樣品同時(shí)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果確實(shí)存在差異。經(jīng)常檢測人員比其他實(shí)驗(yàn)人員檢測的靈敏度高10?100倍。說明PCR檢測的試驗(yàn)確實(shí)有一定的操作技術(shù)需要熟悉和訓(xùn)練，不同的人員對檢測結(jié)果有一定的影響。加強(qiáng)人員的操作技能的訓(xùn)練是必須的，需要實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對PCR檢測有一個(gè)熟練的過程。PCR污染控制是PCR檢測操作人員必須非常注意一項(xiàng)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室設(shè)置上分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。人員操作也應(yīng)非常注意，比如注意經(jīng)常打掃衛(wèi)生消毒、對移液器要定期進(jìn)行清洗、消毒。及時(shí)試驗(yàn)操作簡便、快速、準(zhǔn)確等。即使上述三個(gè)方面進(jìn)行了很好的控制，仍需要密切注意每次檢測結(jié)果，了解檢測結(jié)果與其它相關(guān)檢測方法的一致性。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部可以2人或多人之間進(jìn)行PCR檢測比對試驗(yàn)，也