實驗七PCR擴增技術(shù)

【實驗?zāi)康摹?/p>

學(xué)習(xí)PCR方法體外擴增DNA的基本原理，掌握PCR技術(shù)的常規(guī)操作，了解PCR引物及參數(shù)的設(shè)計?！緦嶒炘怼慷嗑勖告?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，利用半保留復(fù)制的原理，以待擴增的DNA為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異DNA片段。

PCR擴增經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。PCR具體過程模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈的氫鍵斷裂,DNA解離成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，使PCR反應(yīng)體系溫度降至50-60℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合引物的適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過30個循環(huán)后，理論上可使DNA擴增至10億(230=109)倍。PCR的反應(yīng)動力學(xué)：PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR反應(yīng)五要素參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。PCR常見類型1、巢式PCR：采用兩對引物進行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)。2、不對稱PCR：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。3、反向PCR：是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。4、等位基因?qū)Ｒ籔CR：該法可用于檢測點突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥。5、競爭引物PCR：有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復(fù)性條件下競爭DNA模板，其中只有完全互補的引物才能大量配對。該法可用于測定某一DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換。6、多重PCR：用于檢測特定基因序列的存在或缺失。7、原位PCR：直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進行PCR擴增?？蛇M行細(xì)胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。8、差示PCR：利用特殊設(shè)計的引物，在RT的基礎(chǔ)上進行PCR，以研究不同基因的表達狀況。9、實時定量PCR：實時定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法，實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法?！緦嶒炘噭緿NA模板;Taq酶，擴增緩沖液，ddH2O;瓊脂糖N;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);50TAE電泳緩沖液(儲存液);6*loadingbuffer;溴化乙錠溶液(EB)：0.5mg/ml；引物(20M)：【實驗步驟】在0.2ml的PCR薄壁管里按以下比例配置50l反應(yīng)體系：模板DNA0.5l上游引物1l下游引物1l10擴增緩沖液5ldNTP4lTaq酶0.5lddH2O38l混勻，瞬時離心，按以下條件設(shè)計好程序，進行PCR反應(yīng)；95oC預(yù)變性3min；30個循環(huán)95oC變性30s55oC退火30s72oC延伸1min72oC終止延伸10minPCR反應(yīng)結(jié)束后，取5l樣品，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物【結(jié)果示例】泳道M:DNAmaker;泳道1,2:1500bpPCR產(chǎn)物;泳道3,4:750bpPCR產(chǎn)物【注意事項】PCR反應(yīng)靈敏度很高，為了防止污染，使用的0.2ml的PCR薄壁管和吸頭都應(yīng)該是無污染的。加試劑前，應(yīng)短暫離心10s，然后再打開試劑的管蓋，以防止污染試劑。配置PCR反應(yīng)體系時，Taq酶應(yīng)該最后加入。使用工具酶的操作必須在冰浴的條件下進行，使用后應(yīng)立即將工具酶放回冰箱。dNTP不僅提供DNA復(fù)制的原料，還提供反應(yīng)過程中所需要的能量。通常dNTP應(yīng)分裝小管，存放于-80度或-20度冰箱中，避免過多的凍融，否則會使dNTP的高能磷酸鍵打開。當(dāng)擴增大于5kb的目的片段時，可以使用用于超長PCR的酶或酶混合物以獲得最佳產(chǎn)量。防止殘余（Carry-over）污染。PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染