免疫印跡技術(shù)課稿

雕版印刷是最早在中國(guó)出現(xiàn)的印刷形式，在印刷史上有“活化石”之稱(chēng)，揚(yáng)州是中國(guó)雕版印刷術(shù)的發(fā)源地，是中國(guó)國(guó)內(nèi)唯一保存全套古老雕版印刷工藝的城市。雕版印刷術(shù)是一種具有突出價(jià)值且民族特征鮮明、傳統(tǒng)技藝高度集中的人類(lèi)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。它凝聚著中國(guó)造紙術(shù)、制墨術(shù)、雕刻術(shù)、摹拓術(shù)等幾種優(yōu)秀的傳統(tǒng)工藝，最終形成了這種獨(dú)特文化工藝；它為后來(lái)的活字印刷術(shù)開(kāi)了技術(shù)上的先河，是世界現(xiàn)代印刷術(shù)的最古老的技術(shù)源頭?；緝?nèi)容免疫印跡技術(shù)的原理1基本操作流程2注意事項(xiàng)3免疫印跡技術(shù)的應(yīng)用4課堂小結(jié)5作業(yè)6一、免疫印跡技術(shù)的原理通過(guò)SDS區(qū)分不同大小的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物（硝酸纖維素膜），通過(guò)特異性試劑（抗體）作為探針，與固相支持物上的蛋白質(zhì)（抗原）發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)的Westernblotting技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。④③②

①電泳結(jié)果檢查電泳測(cè)定蛋白樣品濃度收集或提取蛋白樣品二、基本操作流程1、SDS1、SDS

①收集或提取蛋白樣品可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，用SDS上樣緩沖液，裂解能力強(qiáng)，能提取細(xì)胞總蛋白。另外，常用的還有非離子去垢劑緩沖液裂解法，低滲緩沖液裂解法?？梢詤⒖枷嚓P(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提.

二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品

②測(cè)定蛋白樣品濃度一般來(lái)說(shuō)有三種方法：第一種是采用定量試劑盒；第二種是采用光學(xué)檢測(cè)法；第三種直接跑SDS。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品②測(cè)定蛋白樣品濃度

③電泳配制SDS凝膠，在收集的蛋白樣品中加入上樣緩沖液，點(diǎn)樣后接通電源開(kāi)始電泳。利用濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品②測(cè)定蛋白樣品濃度③電泳

④電泳結(jié)果檢查考馬斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多?？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過(guò)固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的WesternBlot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步。同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說(shuō)明問(wèn)題。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法（轉(zhuǎn)移效率較低）和電泳印跡法（常用）。

電泳印跡法用有空的塑料盒有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成“三明治”狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開(kāi)凝膠結(jié)合在硝酸纖維素膜上。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移2、抗原轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移膜的選擇WesternBlot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。膜的選擇根據(jù)：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移

NC膜簡(jiǎn)介硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)蛋白有結(jié)合能力強(qiáng)，適用于各種顯色方法（包括同位素，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色），背景低，性價(jià)比高；使用也很簡(jiǎn)便（不需要甲醛預(yù)處理，只須在無(wú)離子水面浸潤(rùn)排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡；而且容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件）。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間。

二、基本操作流程優(yōu)2、抗原轉(zhuǎn)移

NC膜簡(jiǎn)介但是純的硝纖膜在比較脆，容易卷，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇的，如果小于7KD的話最好選擇的膜。二、基本操作流程缺3、封閉電泳轉(zhuǎn)移后，固相紙膜上還留有無(wú)蛋白組分結(jié)合的區(qū)域，在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行專(zhuān)一性檢測(cè)的時(shí)候，由于免疫學(xué)檢測(cè)試劑中的蛋白質(zhì)（抗體），在與特異性抗原結(jié)合的同時(shí)也會(huì)非特異的結(jié)合固相上的空白區(qū)域，產(chǎn)生高背景，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不明顯，因此要對(duì)這些空白區(qū)域進(jìn)行封閉。最常用的封閉劑就是脫脂奶粉。二、基本操作流程各種常見(jiàn)的封閉劑4、免疫檢測(cè)把已經(jīng)封閉過(guò)的膜放入加入已知抗體的緩沖液中，對(duì)特異性的靶抗原進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)過(guò)程通常會(huì)發(fā)生多步反應(yīng)，一般采用間接檢測(cè)法，常用的檢測(cè)系統(tǒng)有放射性同位素、酶、熒光素等，通過(guò)放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物，從而達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性檢測(cè)和鑒別的目的。二、基本操作流程原理流程圖三、注意事項(xiàng)1．免疫印跡技術(shù)所測(cè)定的只是目的蛋白的相對(duì)含量。因此不能確定一種細(xì)胞含有多少目的蛋白，只能確定該蛋白存在與否及其它條件下與其他細(xì)胞相比蛋白的含量是高還是低。2．比較一種目的蛋白在不同細(xì)胞或者同一細(xì)胞不同條件下的相對(duì)含量時(shí)，各樣品的總蛋白量必須相等。3．選用合適的SDS膠濃度，使目的蛋白可以得到較好的分辨。4．開(kāi)始電泳和轉(zhuǎn)移膜時(shí)，一定要確認(rèn)電極的正負(fù)極接頭是否正確。5．在免疫檢測(cè)中，要注意封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。6．抗體反應(yīng)在封口塑料袋內(nèi)進(jìn)行，一定要驅(qū)除袋內(nèi)的所有氣泡，否則會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)合不均勻。7．操作要輕柔，帶手套，不要再轉(zhuǎn)移膜上造成任何刮痕。在整個(gè)操作中，轉(zhuǎn)移膜要始終在液體中，不能干燥。三、注意事項(xiàng)四、Western-blotting的應(yīng)用

（3個(gè)例子）目前，Western印跡法主要用于未知蛋白質(zhì)的檢測(cè)及抗原組分、抗原決定簇的分子生物學(xué)的測(cè)定；同時(shí)也可用于未知抗體的檢測(cè)和單克隆抗體的鑒定等。很多疾病在不同的發(fā)病階段，即使臨床上還沒(méi)有明顯的癥狀，在蛋白質(zhì)水平就發(fā)生了變化，這些變化有可能成為臨床早期的診斷指標(biāo)。免疫印跡可以用于疾病的早期診斷和預(yù)后的跟蹤分析檢測(cè)。艾滋病的確診檢測(cè)（例1）艾滋病的臨床癥狀持續(xù)發(fā)熱、乏力、腹瀉、食欲不振、體重下降、夜間盜汗、全身淋巴結(jié)腫大、精神抑郁、表情淡漠呈慢性病容，以及由于機(jī)體抵抗力低下，出現(xiàn)一些不常見(jiàn)的條件致病菌感染或機(jī)會(huì)感染性疾病的癥狀。四、Western-blotting的應(yīng)用艾滋病的診斷標(biāo)準(zhǔn)艾滋病病毒抗體陽(yáng)性，又具有下述任何一項(xiàng)者，可為實(shí)驗(yàn)確診艾滋病病人。1)近期內(nèi)(3—6個(gè)月)體重減輕10%以上，且持續(xù)發(fā)熱38℃達(dá)1個(gè)月以上。2)近期內(nèi)(3—6個(gè)月)體重減輕10%以上，且持續(xù)腹瀉(每日3—5次)1個(gè)月以上。3)卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎(P.C.P)。4)卡波西肉瘤(K.S.癥狀是胳膊上或者腿上出現(xiàn)紫色斑塊)。5)明顯的霉菌或其它條件致病菌感染。四、Western-blotting的應(yīng)用大鼠出生前后心肌端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的變化（例2）

目的：探討大鼠心肌組織端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)育規(guī)律。方法：免疫組織化學(xué)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)SD大鼠心肌端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的表達(dá)，圖像分析技術(shù)對(duì)心肌組織TERT的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果：3組大鼠心肌組織中的心肌細(xì)胞、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞均有TERT的表達(dá)。TERT主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。TERT的總表達(dá)規(guī)律是20d胎鼠陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于出生后6d大鼠，出生后12d大鼠心肌表達(dá)最低，3組之間TERT的組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：大鼠心肌組織的端粒酶活性隨著日齡增加，其表達(dá)逐漸減少。四、Western-blotting的應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)肺癌組織上皮鈣粘蛋白的表達(dá)（例3）目的：探討上皮鈣粘蛋白(E-cad)與肺癌及其病理類(lèi)型之間的相關(guān)性.方法：應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)30例肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織及5例肺良性對(duì)照標(biāo)本中E-cad的表達(dá),并對(duì)部分表達(dá)陰性的標(biāo)本用免疫組化方法進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果：癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織E-cad的陽(yáng)性率分別為36.7%、70.O%、96.7%.癌組織陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織，也明顯低于遠(yuǎn)癌組織；癌旁組織E-cad陽(yáng)性率明顯低于遠(yuǎn)癌組織。在30例肺癌患者鱗癌、腺癌及腺鱗癌的癌組織中E-cad陽(yáng)性率分別為33.3%、40.O%、33.3%;鱗癌、腺癌及