紫外分光光度計(jì)姓名：XX專業(yè)：生態(tài)學(xué)學(xué)號(hào)：2013XXX內(nèi)容提要紫外分光光度計(jì)概述紫外分光光度計(jì)的工作原理紫外分光光度計(jì)設(shè)備簡介紫外分光光度計(jì)的特點(diǎn)及吸收光譜紫外可見光譜分析法的應(yīng)用

分光光度計(jì)的進(jìn)展一、紫外分光光度計(jì)概述（一）紫外分光光度計(jì)的原理

紫外分光光度計(jì)是一種常用的理化實(shí)驗(yàn)室分析儀器，是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。可以在紫外可見光區(qū)任意選擇不同波長的光。物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動(dòng)能級(jí)躍遷和電子能級(jí)躍遷的結(jié)果。各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會(huì)相同。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子在電子能級(jí)間的躍遷，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量測(cè)定。吸收光的波長范圍：200-800nm:(1)（近）紫外光區(qū):

200-400nm(2)可見光區(qū):400-800nm

(3)遠(yuǎn)紫外區(qū)：10-200nm（二）紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生

1.分子吸收光譜的產(chǎn)生——由能級(jí)間的躍遷引起物質(zhì)分子內(nèi)部三種運(yùn)動(dòng)形式：

（1）電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)（2）原子核在其平衡位置附近的相對(duì)振動(dòng)（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)

分子具有三種不同能級(jí)：電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)

三種能級(jí)都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量分子的內(nèi)能：電子能量Ee、振動(dòng)能量Ev

、轉(zhuǎn)動(dòng)能量Er即E＝Ee+Ev+Er

分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)涉及三種躍遷能級(jí)，所需能量大小順序：ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

躍遷：電子受激發(fā)，從低能級(jí)轉(zhuǎn)移到高能級(jí)的過程。

分子只有選擇性的吸收(hν=△E)某些波長（頻率）的光才能由較低的能級(jí)躍遷到較高能級(jí)上。

若用一連續(xù)的電磁輻射照射樣品分子，將照射前后的光強(qiáng)度變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并記錄下來，就可得到光強(qiáng)度變化對(duì)波長的關(guān)系曲線，即為分子吸收光譜。2．紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生

由于分子吸收紫外-可見光區(qū)的電磁輻射，分子中價(jià)電子（或外層電子）的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生紫外-可見吸收光譜。

電子能級(jí)間躍遷的同時(shí)總伴隨有振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶，即帶狀光譜。（線狀光譜）（三）分光光度計(jì)發(fā)展概況1、1665年，牛頓曾做一個(gè)實(shí)驗(yàn)：由暗室的小圓孔透過太陽光，形成了一細(xì)太陽束，光束再經(jīng)過棱鏡色散后，在墻壁上呈現(xiàn)了紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫的色帶,這色帶即被稱之為“光譜”。2、1760年郎伯(J.H.Lambert)發(fā)現(xiàn)物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的厚度成正比,后被稱之為郎伯定律。3、1852年比耳發(fā)現(xiàn)物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比,后被稱之為比耳定律。4、20世紀(jì)早期已經(jīng)有了商業(yè)化光譜儀,但光譜儀的微小型化趨勢(shì)開始于20世紀(jì)90年代初期。5、目前，在國內(nèi)外都已有了眾多的近紫外、可見光和近紅外波長范圍的微小型光譜儀的生產(chǎn)商。國外比較著名的有美國oceanoptiCS(海洋光學(xué))公司、荷蘭AvanteSB.V.公司、日本島津公司、美國安捷倫公司、英國oxford工nstrumentS(牛津儀器)等等。國內(nèi)的產(chǎn)品主要有上海分析儀器總廠的75和76系列、上海棱光的551/2/3/4、天美科學(xué)儀器有限公司8500、北京普析通用儀器公司TUZ系列、北京瑞利分析儀器公司LJvl/9100系列、天津光學(xué)儀器廠的wFz系列等等。二、紫外分光光度計(jì)的工作原理1、吸光度和透光度設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia,透射光強(qiáng)度為

It，反射光強(qiáng)度為Ir，則I0=Ia+

It+Ir由于反射光強(qiáng)度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為：

I0=Ia+

It透光度：透光度為透過光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之

比，用T表示：即T=It/I0吸光度:為透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It2、朗伯-比爾定律

朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即A=κcl

式中比例常數(shù)κ與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。

紫外分光光度計(jì)的理論基礎(chǔ)是朗伯一比爾定律。儀器的工作原理為：（1）光源發(fā)出的光由聚光系統(tǒng)會(huì)聚后射向入射狹縫；（2）準(zhǔn)直系統(tǒng)將來自入射狹縫的光會(huì)聚為平行光后射向光柵,光柵將復(fù)合光色散(使不同波長的光按照不同的角度出射)；（3）光譜聚焦系統(tǒng)將經(jīng)光柵色散的光聚焦使之成為按波長排列的光譜帶。（4）波長掃描機(jī)構(gòu)帶動(dòng)光柵轉(zhuǎn)動(dòng)，使從出射狹縫射出的單色光波長線性變化。（5）單色光經(jīng)過樣品池(樣品池是標(biāo)準(zhǔn)的比色皿樣品池，其中裝有被測(cè)樣品)被其中的樣品所吸收，最后到達(dá)光電倍增管(光電接收器)，經(jīng)過光電變換后輸出電信號(hào)。（6）電信號(hào)經(jīng)控制電路與信號(hào)處理電路后得到數(shù)字結(jié)果，數(shù)字結(jié)果經(jīng)過串行通訊傳送到計(jì)算機(jī)。（7）由計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到光譜圖或各種光譜數(shù)據(jù)。3、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（2）溶液的不均性。實(shí)際樣品的混濁，加入的保護(hù)膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸光特性變化大。（3）光程的不一致性。光源不是點(diǎn)光源，比色皿光徑長度不一致，光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。三、紫外分光光度計(jì)設(shè)備簡介紫外分光光度計(jì)盡管光度計(jì)的種類和型號(hào)繁多，但是它們都是由下列基本部件組成的：（一）基本組成部分1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm?，F(xiàn)多用碘鎢燈。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜?，F(xiàn)多用氘燈。

2.單色器

單色器是從連續(xù)光譜中獲得所需單色光的裝置。常用的有棱鏡和光柵兩種單色器。

棱鏡單色器的缺點(diǎn)是色散率隨波長變化，得到的光譜呈非均勻排列，而且傳遞光的效率較低。

光柵單色器在整個(gè)光學(xué)光譜區(qū)具有良好的幾乎相同的色散能力。因此，現(xiàn)代紫外-可見分光光度計(jì)上多采用光柵單色器。包括以下部分：

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光：棱鏡或光柵；④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池，也可用石英池。要求：兩個(gè)的透光率相差要小于0.5％。玻璃360nm2.25mm石英200nm2.5mm吸收池的形狀波長范圍、使用注意事項(xiàng)：容易破碎可拆卸圓形測(cè)量池兩面透光圓形測(cè)量池兩面透光1cm長方形測(cè)量池兩面透光氣體測(cè)量池兩面透光微量測(cè)量池兩面透光流動(dòng)測(cè)量池兩面透光4.檢測(cè)器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理（二）分光光度計(jì)的分光類型1.單光束

簡單，價(jià)廉，適于在給定波長處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。（三）影響紫外-可見吸收光譜的因素

物質(zhì)的吸收光譜與測(cè)定條件有密切的關(guān)系。測(cè)定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。1.溫度

在室溫范圍內(nèi)，溫度對(duì)吸收光譜的影響不大。2.溶劑

注意如下幾點(diǎn)：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測(cè)物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3、pH效應(yīng)的影響

pH的改變可能引起共軛體系的延長或縮短，或引從而引起吸收峰位置改變。O-λmax235，287nmOHλmax211，270nmOH-H+四、紫外分光光度計(jì)的特點(diǎn)及吸收光譜1儀器設(shè)備和操作都比較簡單，價(jià)格

低，分析速度較快。2靈敏度較高。3有較好的選擇性。通過適當(dāng)?shù)剡x擇測(cè)量條件，一般可在多種組分共存的體系中，對(duì)某一種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。（一）特點(diǎn)4精密度和準(zhǔn)確度較高。在儀器設(shè)備和其他測(cè)量條件較好的情況下，其相對(duì)誤差可減小到1％一2％。

5用途廣泛。醫(yī)藥、化工、冶金、環(huán)境保護(hù)、地質(zhì)等諸多領(lǐng)域---已成為必不可少的測(cè)試手段之一。（二）吸收光譜1.物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

物質(zhì)對(duì)光的吸收是選擇性的，利用被測(cè)物質(zhì)對(duì)某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)。通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收強(qiáng)度（吸光度），以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得出該物質(zhì)在測(cè)定波長范圍的吸收曲線。在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長λmax進(jìn)行物質(zhì)含量的測(cè)定。2、有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜飽和烴及其取代衍生物

飽和烴類：只能產(chǎn)生*躍遷，最大吸收峰一般小于150nm。芳香族化合物E1、E2帶、B帶

苯環(huán)上有取代基時(shí)，三個(gè)吸收帶都長移，吸收強(qiáng)度也增大。B帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)因取代基而變得簡單化。羰基化合物

產(chǎn)生*、n*、n*三個(gè)吸收帶。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。五、紫外可見光譜分析法的應(yīng)用紫外可見分光光度法定性分析對(duì)比吸收光譜的一致性對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對(duì)比吸光度(或吸光系數(shù))的比值定量分析單組分法吸光系數(shù)法校正曲線法對(duì)照法多組分法解方程組法雙波長法系數(shù)倍率法導(dǎo)數(shù)光譜法褶合光譜法結(jié)構(gòu)分析結(jié)