第一節(jié)概述一、基本概念核酸與核苷類藥物是指具有藥用價值的核酸、核苷酸、核苷或者堿基天然的、類似物、衍生物及其聚合物作用：影響生物的蛋白質合成和脂肪、糖類的代謝恢復正常代謝或干擾某些異常代謝用途：放射病、血小板減少癥、白細胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、病毒病第1頁/共28頁核酸是一種多聚體大分子，它的組成單元是核苷酸，將核苷酸中的磷酸基團去掉，剩余部分稱核苷，核苷進一步分解可生成戊糖和堿基。胰核酸酶胰、腸核苷酸酶核苷酶第2頁/共28頁嘌呤核苷酸GMPAMP嘧啶核苷酸的結構第3頁/共28頁核酸類藥物分類

——具有天然結構的核酸類物質如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+)

、CoII(NADP+)

。這類藥物有助于改善物質代謝和能量平衡，修復受損組織，促使缺氧組織恢復正常生理機能。臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動脈或冠狀動脈硬化、肝炎等的治療或輔助治療。肌苷(IMP)：用于急慢性肝炎、肝硬化、白細胞減少、血小板減少等。第4頁/共28頁核酸類藥物分類

——自然結構核酸類物質的類似物和聚合物它們是當今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。主要有疊氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。第5頁/共28頁他莫昔芬擾雌激素的某些活動,模擬其它雌激素作用.用于治療某些乳腺癌和卵巢癌.第6頁/共28頁（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸

1、酶解法制備脫氧核苷酸桔青霉產(chǎn)生5`-磷酸二脂酶

紅酵母產(chǎn)生3`-磷酸二脂酶二、核苷酸的生產(chǎn)方法第7頁/共28頁

第8頁/共28頁2、酶解法制備戊糖核苷酸

我國從60年代開始使用核酸酶P1降解核糖核酸生產(chǎn)單核苷酸，日本年產(chǎn)呈味核苷酸（肌苷酸和鳥苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。酶解法生產(chǎn)5‘-單核苷酸工藝流程第9頁/共28頁3．菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸磷酸二酯酶在合適的條件下降解細胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5’-核苷酸。在國內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn)5’-核苷酸。菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸工藝流程：第10頁/共28頁4．堿水解法生產(chǎn)2’,3’-混合核苷酸RNA結構中的磷酸二酯鍵對于堿性條件不穩(wěn)定,很容易生成2,3-環(huán)狀磷酸酯,此環(huán)狀磷酸酯對堿更不穩(wěn)定,很易加水分解生成2,3-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液,加氫氧化鈉達0.3mol/L濃度,升溫至38℃,保溫16～20小時,用6mol/L鹽酸中和至pH7.0,從RNA水解成2,3-核苷酸的降解率達95％以上,將2,3-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片劑,經(jīng)臨床使用,對非特異性血小板減少癥、對白血球減少癥、癌腫的化療和放療后的升白血球均有較好療效。第11頁/共28頁（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸1．發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）2、發(fā)酵生產(chǎn)黃苷酸（XMP）及酶法轉化成鳥苷酸第12頁/共28頁IMP生成總反應過程第13頁/共28頁①SAMP合成酶③IMP脫氫酶②SAMP裂解酶④GMP合成酶AMP和GMP的生成SAMP黃苷酸肌苷酸肌苷酸肌苷酸第14頁/共28頁（三）半合成法制備核苷酸(略)由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下加入氯化氧磷，進行磷酸化，從核苷生成5’-核苷酸收率可達90%。例一：肌苷2mmol/L懸浮于5ml磷酸三乙酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmol/L，反應2h，5’-IMP摩爾產(chǎn)率達91％。例二：鳥苷2mmol/L懸浮于5ml磷酸三甲酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmo/L，反應6h，5’-GMP摩爾產(chǎn)率達90%。第15頁/共28頁第二節(jié)核酸類物質的生產(chǎn)

一、RNA的提取與制備1.RNA的工業(yè)來源從微生物中提取RNA，是工業(yè)上最實際和有效的方法，一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細菌中RNA占5％-25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%~28%,面包酵母含RNA4.1％～7.2％。

2.高RNA含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA。可以從自然界篩選并可用誘變育種的方法提高酵母的RNA含量。第16頁/共28頁發(fā)酵法生產(chǎn)高含量RNA酵母及其RNA提取工藝流程見圖第17頁/共28頁2.RNA提取實例第18頁/共28頁二、DNA的提取與制備

DNA，可以促進細胞的活化，調節(jié)新陳代謝，延緩機體衰老，維護正常免疫功能有積極的作用。1．工業(yè)用DNA的提取從冷凍魚精中提取。魚精中主要含有核蛋白、酶類以及多種微量元素。核蛋白的主要成分是脫氧核糖核酸(DNA)和堿性蛋白質(魚精蛋白)，其中DNA占大約2／3。第19頁/共28頁2．具有生物活性DNA的制備可從動物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件0～3℃。動物內(nèi)臟加4倍量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機搗碎1分鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后離心，將沉淀懸浮于20倍量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％十二烷基磺酸鈉，并攪拌2～3小時，在0℃2500rpm離心，在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。第20頁/共28頁三、核苷類藥物的制備

發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。用發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有著許多共同特點：①它們都使用磷酸單酯酶活力很強的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌為誘變出發(fā)菌株；②它們都是通過使用物理或化學誘變方法選育出在遺傳性狀上具有特定標記的誘變菌；③它們在發(fā)酵培養(yǎng)時必須提供限量的生長因素，并且好氧，在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。第21頁/共28頁ADPAMPGMPGTPGDPSAMPIMPXMPAMP脫氨酶IMP脫氫酶GMP還原酶SAMP合成酶PRPPAICARSAICARPRPPATPSAMP裂解酶GMP合成酶

在右邊的合成途徑中，嘌呤核苷酸生物合成的第一個酶PRPP轉酰胺酶受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的強烈抑制而受鳥嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP脫氫酶受最終產(chǎn)物GMP及鳥嘌呤衍生物反饋抑制，SAMP合成酶受AMP反饋抑制的?？莶輻U菌的腺嘌呤缺陷型，當培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時就累積肌苷。而枯草桿菌的腺嘌呤、黃嘌呤缺陷型，當培養(yǎng)基中提供限量鳥嘌呤時就累積腺苷?？莶輻U菌的嘌呤核苷酸合成途徑PRPP轉酰胺酶強弱第22頁/共28頁生產(chǎn)菌株：（1）酶6、7缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累IMP---肌苷（肝炎輔助藥）；（2）酶4缺失（為鳥嘌呤缺陷型）積累XMP---黃苷；（3）酶5缺失積累鳥苷。第23頁/共28頁肌苷生產(chǎn)菌（AJ11102）遺傳性狀：（菌種見P197）①腺嘌呤缺陷型（A-）；②GMP還原酶缺失（GMPred-）；③磺胺脒抗性（SGr）；④精氨酸缺陷型（Arg-）。選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率達20g/L.（一）發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或Iou）第24頁/共28頁碳源為葡萄糖；保證充足的氮源（肌苷高的含N）；Mg+、Ca+有促進作用；最適發(fā)酵溫度為30--34℃，pH6.0—6.2；需大風量,高溶氧和低CO2第25頁/共28頁（二）聚肌胞苷酸（聚肌胞）(略)1、結構與性質1967年美國人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞是干擾素誘導物，而且具有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導劑，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化鈉溶液。2、生產(chǎn)工藝70年代中期我國開始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下：1）底物5’-核苷二磷酸吡啶鹽的制備（P199）第26頁/共28頁（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰浴中的載體，得到共價結合的固定化多核苷酸磷酸化。3）PolyI：C制備（1）底物預處理：CDP吡啶鹽轉成鋰鹽，IDP轉成鈉鹽。（2）酶促反應：（每毫升反應液含μmol／L數(shù)）IDP或

CDP15；Tris150；MgC126；

2）固定化多核苷酸磷酸化酶的制備第27頁/共28頁EDTA1；聚合酶5