非編碼RNA研究方法及應用長鏈非編碼RNA

長度在200nt以上、不編碼蛋白、但參與細胞內多種生物學過程的RNA分子.人類基因組計劃研究發(fā)現(xiàn)只有3%的基因組序列是編碼蛋白質的基因，而占人基因組62%的序列轉錄為lncRNA，這一結論提示非編碼區(qū)域可能通過表達lncRNA，活躍地參與到生物學功能的調控中.截至目前，在NONCODE中已經收錄了73370個lncRNA，它們分別來自1239個物種，僅有不到200個進行了功能注釋，人類對lncRNA的研究還知之甚少.隨著對lncRNA在哺乳動物進化及人類疾病發(fā)生發(fā)展中作用的日益關注，lncRNA調控機制已成為當前生命科學研究的新熱點.1)在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)(橘色)轉錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因(藍色)的表達(如酵母SER3基因);2)抑制RNA聚合酶Ⅱ,或介導染色質重構和組蛋白修飾，而影響基因(藍色)表達；3)lncRNA(紫色)與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，進而產生不同的剪切形式；4)lncRNA(紫色)與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶作用下產生內源性的siRNA,調控基因的表達水平；5)lncRNA(綠色)結合在特定蛋白質上調節(jié)相應蛋白的活性；6)作為結構組分與蛋白質形成核酸蛋白質復合體；7)結合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質定位；8)可作為小分子RNA(如miRNA)的前體分子。Signalarchetype（信號原型）：作為轉錄活性的分子信號或指示劑。Decoyarchetype（誘餌原型）：與其他調控RNA或蛋白結合并隔離。Guidearchetype（指導原型）：指導核糖核蛋白復合物定位到特定目標。Scaffoldarchetype（支架原型）：作為相關分子元件（蛋白和/或RNA）組裝的平臺。

LncRNA的分類lncRNA命名指導標準

每一條lncRNA的名字應具有唯一性

.lncRNA的名字應是描述基因的縮寫.lncRNA名字僅由拉丁字母和阿拉伯數字組成

.lncRNA的名字中不應涉及具體的物種類型

.lncRNA的標識應避免采用一些常用的詞匯.lncRNA的標識應盡可能的反映其功能

.功能性轉錄假基因應包含它們假基因的名字.首先，每條lncRNA的名字應具有唯一性，不能發(fā)生一個基因幾個名字或存在重名的現(xiàn)象。因而，作者在發(fā)表新lncRNA時，可先獲取HGNC的認可，如果作者發(fā)布的名字已在其他地方使用過，HGNC將會指定一個新名字供作者選擇。lncRNA的名字應是描述基因的縮寫，便于人們理解名字的含義。如BANCR就是BRAF-activatednon-proteincodingRNA的縮寫。lncRNA的名字應僅由拉丁字母和阿拉伯數字組成，不應出現(xiàn)標點符號。連字符僅在特殊場合使用，如：反義編碼蛋白基因可在標識中加連字符（BACE1-AS就是BACE1antisenseRNA的名字）。lncRNA的名字中的字母應為大寫，為了與其它種類物種的基因區(qū)別開來（如嚙齒動物基因的標識只要求首字母大寫，其余小寫），人類基因標識中的字母都應為大寫，例如HOTAIR基因，在人類中叫HOTAIR，而在老鼠中寫成Hotair。lncRNA的名字中不應涉及具體的物種類型，例如：如果基因名字中有H/h（代表人類），由于牽涉到同源基因的問題，就會造成一些疑惑和誤導。lncRNA的命名應避免采用一些常用的詞匯，否則會給分析研究帶來很多問題，比如：“AIRN”基因最初公布時叫“AIR”，從公共數據庫中搜索可得到22萬條不相關的信息，而搜索“AIRN”則只有10條信息。lncRNA的命名應盡可能的反映其功能，如XIST基因是“X(inactive)-specifictranscript”的縮寫，該基因的作用是參與沉默一對X染色體的轉錄。命名的時候盡量反映基因通常的功能，而不體現(xiàn)其突變表型。其命名應簡潔明了，不應包含以下信息：*具有攻擊或輕蔑的色彩。*具有個人及地方色彩。*含有神化，虛構或歷史人物的名字。*含有“臆想”和沒什么意義的信息。功能性轉錄假基因在命名時應保留它們假基因名稱且不應改變其基于功能的名稱。為了方便搜索，這個功能應加在名字的最后。eg:PTENP1是“phosphataseandtensinhomologpseudogene1(functional)”.而對于未知功能的lncRNA應依據基因組上下文來命名，下圖則給出了系統(tǒng)化的命名的規(guī)則。如果有一個很接近的蛋白編碼基因，lncRNA的名字應該以這個編碼基因名字開始，再加后綴即可。后綴的分類：反義（antisense，AS），eg:BACE1-AS；內含子(intronic，IT），eg:SPRY4-IT1；重疊（overlapping，OT），eg:OSX2-OT；長鏈基因間lncRNA（LongintergeniclncRNAs，lincRNAs），以LINC為前綴，數字為后綴，eg:LINC00485。此外，有些lncRNA與編碼基因是頭碰頭（headtohead），可推斷它們擁有雙向啟動子，HGNC推薦將其命名為反義上游（Antisenseupstream，AU），例如，GENE2-AU1。lncRNA特征通常較長，具有mRNA樣結構，經過剪接，具有polyA尾巴與啟動子結構，分化過程中有動態(tài)的表達與不同的剪接方方式.啟動子同樣可以結合轉錄因子，如Oct3/4，Nanog,CREB,Sp1,c-myc,Sox2與p53，局部染色質組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結構特征.大多數的lncRNAs在組織分化發(fā)育過程中，都具有明顯的時空表達特異性.在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達方式.序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類之外的其它生物中找到.

LncRNA在生物體內的功能

生物學功能：與表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控、miRNA調控、細胞分化及發(fā)育等密切相關；應急功能：可作為細胞內各種信號招募蛋白形成復合物參與免疫反應和宿主防御。LncRNA與疾?。号c人類許多疾病，尤其是與衰老相關疾病有密切關系，例如心血管疾病、阿爾茲海默癥、糖尿病、癌癥等.LncRNA未來能否作為分子靶標成功應用于臨床診斷和癌癥治療，是發(fā)展的難點與熱點.lncRNA表達特異性LncRNA與臨床疾病的關系大量研究表明，lncRNA從轉錄和轉錄后水平參與蛋白質編碼基因調控，其中包括發(fā)育相關基因及疾病發(fā)生相關基因。通過參與調控蛋白質編碼基因，lncRNA既能影響細胞內信號轉導途徑，也能影響生物體發(fā)育過程中的信號轉導通路。lncRNA（ATXN80S)在RNA水平上參與8型脊髓小腦共濟失調證的（spinocerebellarataxiatype8,SCA8)的發(fā)生。LncRNA失調有望成為人類復雜性疾病發(fā)病的主要原因。

LncRNA對基因表達的調控LncRNA可從染色質重塑、轉錄調控及轉錄后加工等多種層面實現(xiàn)對基因表達的調控LncRNA的順式和反式調控作用1.LncRNA篩選通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進行l(wèi)ncRNA表達譜分析;通過生物信息學方法篩選出具有表達差異的lncRNA，構建共表達網絡，預測lncRNA的靶基因;通過PCR或NorthernBlot技術對候選lncRNA驗證，確定其表達差異。2.LncRNA全長克隆可以通過5'RACE獲取lncRNA5'全長，3'RACE獲取lncRNA3'全長，最終拿到完整的lncRNA序列。3.

表達分析細胞水平表達：在細胞水平進行檢測表達差異。組織分布：檢測不同組織、不同階段表達特性。表達水平動力學變化：比較不同處理條件下，如藥物處理、誘導處理下，表達水平差異。LncRNA的一般研究策略

4.功能研究功能獲得性研究：構建lncRNA過表達載體。原則上是將全長lncRNA定向克隆到表達載體上實現(xiàn)lncRNA的過表達。然而有些lncRNA很大或全長尚未分離，這時將視lncRNA在基因組上的定位采取不同的研究策略。功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預lncRNA后檢測其對疾病相關基因表達影響和對細胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉移等的影響?？赏ㄟ^RNApulldown、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結合的DNA、RNA、蛋白質。采用lncRNA芯片分析技術結合mRNA對lncRNA功能進行預測，研究lncRNAtrans和cis作用機制。lncRNA測序實驗流程采用配體指數級富集系統(tǒng)進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，設計一種RNA配體，與癌癥相關的lincRNA結合達到抑制腫瘤細胞的生長和轉移。采用快速預測RNA與蛋白質相互作用與結構域（catRAPID）在線算法來預測RNA與蛋白質的相互作用，該算法根據RNA和蛋白質的二級結構、氫鍵和分子作用力來評估它們之間的相互作用的傾向。采用非編碼RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技術對lncRNA進行功能缺失（Loss-of-function）研究和細胞定位，該技術是在基于核糖核酸內切酶制備的小干擾RNA（esiRNA）和熒光原位雜交（FISH）2種現(xiàn)有研究方法的基礎上建立起來的。5.表達調控：將lncRNA表達與其他領域相結合，解釋lncRNA調控機理。DNA甲基化：可通過檢測相應基因甲基化差異與lncRNA結合分析。轉錄因子：研究lncRNA與轉錄因子的調控機制。染色質重塑：lncRNA表觀調控。ceRNA機制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調控機制。內源性競爭RNA（competingendogenousRNAs，ceRNA）揭示了一種RNA間相互作用的新機制。已知miRNA可以通過結合mRNA導致基因沉默，而ceRNA可以通過競爭性地結合miRNA來調節(jié)基因表達。ceRNA可以結合miRNA響應元件（microRNAresponseelements，MREs)影響miRNA導致的基因沉默。LncRNA的一般研究實驗手段

與蛋白質的相互作用識別lncRNA的蛋白質伙伴，可以為它們的功能的機制和路徑提高線索。RNA結合蛋白免疫沉淀（RNABindingProteinImmunoprecipitation，RIP）技術，如chemical-cross-linkedRIP、nativeRIP(nRIP)、UV-crosslinkedimmunoprecipitation(CLIP)等通過使用抗體來pulldown核蛋白復合物，然后從中分離相關RNA用于分析。每個變體都有它各自優(yōu)勢和缺陷。nRIP提供交聯(lián)產物，而CLIP在避免交聯(lián)產物的重新組合的同時用于識別RNA與蛋白質相互作用位點。這些技術可以結合高通量測序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，來識別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質因子，盡管還需要技術手段的確認。與DNA的相互作用

以染色體免疫共沉淀(ChIP)和RIP技術的原理為基礎，使用染色體RNA免疫共沉淀(ChRIP)來識別與特殊染色體標簽相互作用的RNA。另一方面，chromatinoligo-affinityprecipitation(ChOP)、chromatinisolationbyRNApurification(ChIRP)、capturehybridizationofRNAtargets(CHART)使用標記的互補寡核苷酸來識別與目的RNA相互作用的DNA位點。結構特征

lncRNA可以形成特殊的二級和三級結構來執(zhí)行它們的功能。通過selective2’-hydroxylacylationanalyzedbyprimerextension(SHAPE)和in-lineprobing來獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，連接其它依賴于RNA酶消化的技術，如fragmentationsequencing(FragSeq)和parallelanalysisofRNAstructure.

疾病相關LncRNA研究思路生物標記物篩選（組織樣本）LncRNA芯片在醫(yī)學科研領域的應用利用LncRNA芯片揭示TSA治療肝癌的機制ceRNA機制揭秘lncRNA促進腫瘤轉移機制

miRNA與lncRNA在基因表達調控中的作用機制（