實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色法第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)一存在問題1、香柏油要加適量2、涂完菌后接種環(huán)一定要灼燒滅菌3、無菌操作4、擦鏡紙浪費(fèi)5、載玻片要洗干凈6、畫圖不符合要求第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日細(xì)菌個(gè)體微小半透明

未染色細(xì)菌大致形態(tài)大小單染色法復(fù)染色法能看清形態(tài)大小但是無鑒別意義能看清形態(tài)大小又有鑒別意義顯微鏡細(xì)菌的染色第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。

2、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)和無菌操作技術(shù)。第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭氏染色法：是1884年由丹麥病理學(xué)家所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。（二）實(shí)驗(yàn)原理——革蘭氏染色原理第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭陽性菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成肽聚糖（15-50層）細(xì)胞膜（雙層脂質(zhì)

蛋白嵌鑲）脂質(zhì)蛋白質(zhì)β-1,4糖苷鍵N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸四肽鏈五肽橋第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭陰性菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成外膜肽聚糖（1-3層）細(xì)胞膜脂質(zhì)蛋白質(zhì)脂質(zhì)雙層脂蛋白脂多糖第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日G+菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量較高，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)緊密，含脂量低，當(dāng)被酒精脫色時(shí)，引起了細(xì)胞壁肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑縮小以至關(guān)閉，從而阻止了不溶性結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的逸出，還是原來的顏色。

Gˉ肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，含較多類脂質(zhì)，故用乙醇處理后，類脂質(zhì)被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細(xì)胞被脫色，經(jīng)沙黃復(fù)染呈紅色。結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染涂片固定（二）實(shí)驗(yàn)原理——革蘭氏染色原理第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

芽孢（內(nèi)生孢子）及其研究芽孢的重要性芽孢是某些G+菌形成的圓形或橢圓形的休眠體，抗熱性和折光性較強(qiáng)。芽孢的大小、形態(tài)、位置可做分類依據(jù)。

（二）實(shí)驗(yàn)原理——芽孢染色法原理第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日中央芽孢偏端芽孢游離芽孢末端芽孢第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日（二）實(shí)驗(yàn)原理——芽孢染色法原理芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難；但當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，染料可進(jìn)入菌體和芽孢；進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后可被脫色；當(dāng)用對比度大、淺色的復(fù)染色劑（番紅）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色（綠色），而菌體呈復(fù)染劑顏色（紅色）。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日1、活材料：革蘭氏染色：培養(yǎng)12h-16h枯草桿菌（Bacillussubtilis）和培養(yǎng)24h大腸桿菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培養(yǎng)28-36小時(shí)的蠟狀芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）2、染色液和試劑：革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅；芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液；二甲苯、香柏油。3、器材：載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。（三）實(shí)驗(yàn)器材第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日1.細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作（1）涂片載玻片1張，加1滴生理鹽水，取菌研磨均勻。（2）干燥室溫干燥，或置酒精燈高處慢慢烘烤。（3）固定干燥后的涂片，在酒精燈火焰中通過3次。（四）實(shí)驗(yàn)步驟——革蘭氏染色第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日2.革蘭法染色（1）初染結(jié)晶紫2min細(xì)水沖洗甩去積水（2）媒染盧戈碘液1min細(xì)水沖洗甩去積水（3）脫色95%乙醇20-30s細(xì)水沖洗甩去積水（4）復(fù)染番紅3min細(xì)水沖洗甩去積水（四）實(shí)驗(yàn)步驟——革蘭氏染色第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日3.觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果待標(biāo)本自干或用吸水紙吸干后，置顯微鏡下檢查。革蘭陽性菌（G+），被染成藍(lán)紫色。革蘭陰性菌（G-），被染成紅色。（四）實(shí)驗(yàn)步驟——革蘭氏染色第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)程序Ⅰ（革蘭氏染色的方法和步驟）涂片蒸餾水涂片結(jié)晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色20~30s初染1min、后水洗固定

番紅復(fù)染2min干燥

鏡檢水洗時(shí)不要直接沖菌膜水洗水洗水洗每人取大腸桿菌和枯草桿菌，做一塊混合涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。2分鐘1分鐘3分鐘干燥固定第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日

取一干凈載玻片→→在兩端各加一滴生理鹽水→→無菌操作取菌種→→涂于生理鹽水中（成菌膜）→→自然干燥→→火焰固定→→初染（結(jié)晶紫，2min）

→→水洗→→媒染（碘液，1min）

→→水洗→→脫色（乙醇，20-30s）

→→水洗→→復(fù)染（蕃紅，3min）

→→水洗→→自然干燥→→觀察。（四）實(shí)驗(yàn)步驟——革蘭氏染色第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日涂片時(shí)，滴生理鹽水不要過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜??；酒精脫色：是革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵，要求脫至流出的乙醇不帶顏色為止，立即水洗。若脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染為陰性菌。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后（沖反面），應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。革蘭氏染色注意事項(xiàng)第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日制備菌懸液染色涂片固定脫色復(fù)染鏡檢改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（四）實(shí)驗(yàn)步驟——芽孢染色第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---制備菌懸液生理鹽水

1、滴生理鹽水

挑取2-3環(huán)菌苔與生理鹽水混勻2、制備菌懸液在EP管中滴2滴生理鹽水第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---染色5%孔雀綠染液1、滴加孔雀綠染液沸水浴加熱15-20min2、加熱染色在離心管中滴2-3滴孔雀綠染液第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---涂片固定經(jīng)孔雀綠染色細(xì)菌懸液1、滴菌懸液用接種環(huán)均勻涂布2、涂片接種環(huán)取菌懸液在載玻片中央

3、干燥室溫自然晾干4、固定通過酒精燈火焰3次固定第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---復(fù)染0.5%番紅水溶液1、滴番紅水溶液滴加數(shù)滴番紅染液在菌膜上，染色2min2、水洗不要直接沖菌膜第二十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日蠟狀芽孢桿菌（B.cer）1、制備菌液：加2滴蒸餾水于1.5ml離心管中，用接種環(huán)從斜面挑取菌體2-3環(huán)于離心管中充分混勻。（2人一組）2、染色：加孔雀綠2-3滴于小試管中。3、加熱：沸水浴，15-20分鐘。4、