實驗層析技術(shù)血清球蛋白的分離純化與鑒定第一頁，共三十頁，2022年，8月28日層析技術(shù)實驗原理實驗思路實驗流程及操作注意事項第二頁，共三十頁，2022年，8月28日層析技術(shù)1.定義：層析法，又稱色譜法，是一種廣泛運用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù).第三頁，共三十頁，2022年，8月28日2.分離依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異—吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。第四頁，共三十頁，2022年，8月28日固定相—固定不動

流動相—對固定相作單向相對運動，推動樣品中各組分通過固定相向前移動。各組分理化性質(zhì)不同，對流動相和固定相具有不同的作用力，因此在流動相推動樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達到分離。3．基本原理：固定相和流動相第五頁，共三十頁，2022年，8月28日4．分類：

①流動相的物理狀態(tài)：氣相和液相

→

氣液/固，液固/液

②方式：紙、薄層、柱

③原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相第六頁，共三十頁，2022年，8月28日5．凝膠層析

(凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析)

①定義：指混合物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。第七頁，共三十頁，2022年，8月28日②基本原理：

固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。

流動相：洗脫液pH7.4磷酸鹽緩沖液第八頁，共三十頁，2022年，8月28日交聯(lián)葡聚糖凝膠多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)珠狀顆粒，商品名為SephadexG系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯數(shù)字表示不同的規(guī)格型號，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八種，具體含義為凝膠得水值的10倍或吸水量（g）/10g干膠交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性小；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸水性大。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。第九頁，共三十頁，2022年，8月28日長鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接第十頁，共三十頁，2022年，8月28日凝膠層析的基本原理樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動而向下移動，同時作垂直向下運動和不定向擴散運動→小分子可進入凝膠空內(nèi)部，流程長，速度慢，后流出；大分子不能進入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動，流程短，先流出→大小分子彼此分開第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日③影響因素*層析柱的選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子。*洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性*加樣量：1%～5%*凝膠的再生第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日離子交換層析定義:離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)而進行的分離方法.第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日原理:離子交換交換層析是利用離子交換劑對各種離子的親和力不同，借以分離混和物中各種離子的一種技術(shù)。其主要特點是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日分類:陰離子交換劑帶正電荷，與混合物中帶負電的組分結(jié)合陰離子交換層析陽離子交換劑帶負電荷，與混合物中帶正電的組分結(jié)合陽離子交換層析第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)凝膠型號顆粒大?。é蘭)溶脹體積(ml/g)分離范圍（Mr）G-1040～1202～3＜7×102G-1550～1502.5～3.5＜1.5×103G-2550～1504～61×103～5×103G-5040～1209～111.5×103～3×104G-7540～12012～153×103～8×104G-10040～12015～204×103～1×105第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的和個性實驗原理共性：

*生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析

*蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷→鹽析/有機溶劑沉淀

*兩性電解質(zhì)和等電點：pH>pI，蛋白質(zhì)帶負電；反之帶正電→電泳、離子交換層析

*有一定的功能：抗原性→免疫沉淀

個性：蛋白質(zhì)的分子量、等電點、親水程度、形狀不同第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日實驗思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定上午完成先粗后細下午完成第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日①分段鹽析：常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶液pH約4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要調(diào)節(jié)pH值。分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pI不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。實驗流程及操作注意事項第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日影響因素：

①溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可,少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25度比0度時溶解度低，更易鹽析。

②pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pI時溶解度最低。pH=pI效果更好。

③蛋白質(zhì)濃度：濃度高時產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日②凝膠層析脫鹽：常用透析，需時較長，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-25/50過柱，用時較短。

固定相：sephadexG-25

流動相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl）

原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分子。第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日③濃縮：sephadexG-25吸水，利用高分子性質(zhì)。第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日注意事項：

1．硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入

2．流洗柱子：3～4個柱長

3．上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致

4．防止柱上液層干涸

5．洗脫液收集無需分部，用載玻片檢測蛋白，無納氏試劑

6．G-25干膠用紙條少量多次加入，液層高<0.5ml

7.用過的G-25干膠倒入收集缸，回收利用。第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術(shù)。電泳系統(tǒng)：電泳支持介質(zhì)、電泳緩沖液、電場④鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日電泳用于分離物質(zhì)的原理COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一定的等電點，在大于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動，由于各種蛋白質(zhì)的分子大小與結(jié)構(gòu)不同，所帶表面電荷的多少不同，因而在電場中向陽極移動的速度不同。經(jīng)過一定的電泳時間后可形成許多蛋白質(zhì)區(qū)帶，每一個區(qū)帶代表一組遷移率相近似的蛋白質(zhì)。第二十八頁，共三十頁，2022年，8月28日醋酸纖維素薄膜電泳

介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機溶劑后涂成薄膜，具均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強滲透性。

電泳緩沖液：pH8.6的巴比妥緩沖液第二十九頁，共三十頁，