動物細胞培養(yǎng)姓名：李健專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)目錄細胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準備工作細胞培養(yǎng)總原則無菌操作技術(shù)及常規(guī)實驗操作方法1.2細胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準備工作一、細胞培養(yǎng)的必備設(shè)施無菌實驗室超凈工作臺恒溫培養(yǎng)箱其他設(shè)備（電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細胞液氮儲存器、離心機、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）無菌實驗室⑴設(shè)計原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。⑵組成：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時與幾個操作間相通。操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細胞培養(yǎng)，房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。超凈工作臺分類側(cè)流式：氣流由左側(cè)或右側(cè)通過臺面流向?qū)?cè)直流式：氣流從上向下或從下向上流動外流式：氣流向操作者方向吹來注意事項：使用前半小時先開紫外線燈滅菌，再關(guān)滅菌燈啟動風機，然后進行操作。使用后用75％的酒精擦洗臺面。

切記：不要用有機溶劑擦拭擋風玻璃。恒溫培養(yǎng)箱變通電熱恒溫培養(yǎng)箱

CO2培養(yǎng)箱37℃，飽和濕度，5％CO2其他設(shè)備酶標儀二、細胞培養(yǎng)常用器材及處理方法玻璃器材塑料器材橡皮器材金屬器材其他用品玻璃器材常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管。首次使用：重復(fù)使用的處理步驟：自來水刷洗0.1％稀鹽酸浸泡過夜自來水沖洗自來水刷洗硫酸－重鉻酸鉀浸泡過夜自來水沖洗10次雙蒸水沖洗2次單蒸水沖洗3次晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min塑料器材

常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、6孔、

12孔、24孔、96孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。重復(fù)使用的處理步驟：自來水刷洗3％HCl或2％NaOH溶液浸泡過夜自來水充分沖洗雙蒸水沖洗3次紫外線直接照射或輻照滅菌橡皮器材首次使用：自來水刷洗5％NaOH溶液煮沸15min自來水沖洗8次4％HCl鹽酸煮沸15min自來水沖洗8次雙蒸水沖洗1次單蒸水沖洗3次晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min

重復(fù)使用的處理步驟：注意：橡膠器材需用鋁鉑包裝，放在鋁盒內(nèi)高壓蒸汽滅菌。自來水刷洗洗衣粉加熱煮沸10min自來水充分沖洗單蒸水沖洗3次蒸餾水煮沸2次，每次15min晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min雙蒸水沖洗1次其他用品

緩沖液（PBS）：高壓蒸汽消毒

血清：56℃水浴滅活30min

合成培養(yǎng)基：過濾除菌（0.22μm、0.45μm）常見消毒法的適應(yīng)對象紫外線消毒電離輻射消毒高壓蒸汽消毒干熱消毒過濾除菌化學(xué)滅菌法適應(yīng)對象不適應(yīng)對象空氣、臺面、不適于用其它方法消毒的器皿試劑、培養(yǎng)液適于大量消毒且不適于用高壓、過濾消毒的器皿活的生物材料適于絕大多數(shù)器皿試劑玻璃器皿活的生物材料易燃、揮發(fā)性物質(zhì)金屬、橡膠、塑料制品遇熱易變性、失效試劑和培養(yǎng)液含大分子物質(zhì)量高的試劑不能用物理法除菌的物品場所培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃,15磅,20分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃,15磅,20分鐘，然后在烘箱中烘干玻璃瓶：干熱滅菌170℃,4小時。常用物品消毒壓力及時間無菌無毒害的環(huán)境1支持生長增殖的營養(yǎng)2其它類似體內(nèi)的環(huán)境3維持細胞性狀4

細胞培養(yǎng)總原則(一)細胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境實驗室設(shè)計合理常用設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿：透明度好、無毒、利于細胞貼附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。細胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù)工作環(huán)境及表面的處理細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細胞的處理(二)細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。其它成分（條件培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基的主要成分氨基酸碳水化合物無機鹽維生素其它輔助物質(zhì)培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標準型）DMEM-高糖（標準型）DMEM-低糖（標準型）McCoys5AM199F12血清牛血清、馬血清、人血清（1）儲存于-20℃—-70℃低溫冰箱中（2）一般廠商提供的血清為無菌（3）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補體成分（complement）滅活（4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理。血清的主要作用

⑴提供基本營養(yǎng)物質(zhì)

⑵提供貼壁和擴展因子（FN、LN）

⑶提供激素及各種生長因子（FGF、EGF、PDGF)

⑷提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細胞障礙因素）

⑸對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用注意點：

血清型號、種類不同，所含營養(yǎng)因素有差別，不可忽視；在需要觀察細胞某種特性時，血清使問題變復(fù)雜，要除去。血清的使用與儲存

使用前的處理

56℃滅活30min→去除補體成分

（趨勢：大部分細胞培養(yǎng)不需滅活；需要滅活的：巨噬細胞、肥大細胞、血小板、淋巴細胞等）

儲存條件

滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），－20℃儲存；使用前4℃融化。

使用濃度

一般為5％～20％，最常用的是10％。其它常用液體試劑⑴Hank’s⑵D-Hank’s⑶PBS⑷NaHCO3（7.5%

）⑸胰酶溶液（0.25%）0.01MPBS*(pH7.4,高壓滅菌)組分含量(g/L)NaCl8.0KCl0.2Na2HPO4Na2HPO4?7H2ONa2HPO4?12H2O1.442.683.58KH2PO40.24H2O1000

緩沖液1×PBS(Phosphate-BufferedSallines)

消化液⑴作用：分離組織和分散細胞⑵常用消化液：胰蛋白酶二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)⑶通常使用濃度:0.25%Trypsin:0.25ginPBS0.02%-0.03%EDTA:0.02-0.03gEDTApH:7.4；過濾；-20℃保存胰蛋白酶(簡稱胰酶)：黃白色粉末，易潮解，冷暗干燥處保存，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制。目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來自?；蜇i的胰腺胰酶的主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，離散細胞胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰酶簡介胰蛋白酶胰酶對細胞的分離作用與細胞的種類和細胞的特性有密切關(guān)系。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。通常：胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液可終止其對細胞的消化作用。

胰蛋白酶EDTA是一種化學(xué)螯合劑，對細胞毒性小，價格低廉，使用方便。通常與胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，濃度見前面。注意：使用EDTA處理細胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細胞生長。

EDTA·4Na溶液(三)其它類似體內(nèi)的環(huán)境溫度氣體滲透壓氫離子濃度(PH)其他(四)合理的計劃，維持細胞性狀

盡早凍存原代細胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細胞。需要做實驗的細胞要選對數(shù)生長期。防止細胞污染，如遇污染，及時處理。無菌操作技術(shù)體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠?！九囵B(yǎng)前準備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。

【操作前消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。

【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！净鹧嫦尽?/p>

在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行?！静僮鳌窟M行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

1.紫外滅菌：實驗進行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%酒精擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2.無菌操作：

無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%酒精擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。無菌操作常識3.

安全取用：小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。無菌操作常識85培養(yǎng)細胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)細胞計數(shù)培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)細胞計數(shù)：

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2．半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3．貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細胞傳代方法貼壁生長細胞傳代方法：1吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-5min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5離心，細胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。6吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。7加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。8將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。培養(yǎng)細胞活力測定1．臺盼藍法

活細胞不被染色，死細胞染成藍色；

用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力；

方法：

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力；

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

2．四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；

MTT比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍紫色產(chǎn)物（formazan)量成正比。再用酶標儀測定OD值；

MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。操作步驟：（1）單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長490納米）。記錄結(jié)果，繪制細胞生長曲線。常規(guī)觀察需每天觀察細胞生長過程中出現(xiàn)的變化：1.培養(yǎng)液的顏色與透明度2.細胞形態(tài)變化3.

細胞生長狀態(tài)4.微生物污染細胞凍存和復(fù)蘇

細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學(xué)特性變化。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序標準程序：

當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入