生物制藥第七章發(fā)酵工程技術概論第一節(jié)概述第二節(jié)優(yōu)良菌種的選育第三節(jié)發(fā)酵的基本過程第四節(jié)發(fā)酵方式第五節(jié)發(fā)酵工藝控制第六節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取第七節(jié)發(fā)酵設備第八節(jié)基因工程在發(fā)酵工程中的應用第九節(jié)發(fā)酵工程的發(fā)展展望第一節(jié)概述一、發(fā)酵工程（fermentationengineering），又稱微生物工程：通過微生物完整的細胞自催化完成生物化學反應過程，微生物既能正常生長又能過量積累目的產(chǎn)物，提供工業(yè)產(chǎn)品。包括：抗生素、氨基酸、維生素、有機酸、酶制劑、蛋白質(zhì)、基因工程藥物、核酸類物質(zhì)等?？股?、氨基酸、酶制劑等產(chǎn)品為什么能通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)？這與微生物的生長和代謝特點有什么關系？某些微生物因爭奪生存環(huán)境或營養(yǎng)物，會產(chǎn)生抗生素將其他種類的微生物殺死。微生物會產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養(yǎng)物質(zhì)水解成可吸收的小分子多肽或氨基酸、葡萄糖。微生物細胞會通過合成或分解代謝生產(chǎn)它必需的一些物質(zhì)，包括氨基酸、核苷酸等。二、發(fā)酵工程發(fā)展的4個階段第一階段---天然發(fā)酵階段：發(fā)酵技術開始于家庭小制作，傳統(tǒng)的釀酒、制醬等。技術進步緩慢，完全是經(jīng)驗式的，并不知道其中的原理。1675年荷蘭人列文虎克發(fā)明了顯微鏡。法國巴斯德在1857~1876持續(xù)研究發(fā)酵作用。第二階段---傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)階段：開始了解發(fā)酵現(xiàn)象的本質(zhì)，采用開放式的發(fā)酵方式，生產(chǎn)過程及設備較為簡單，規(guī)模不大。1900~1940人工控制微生物發(fā)酵過程（純培養(yǎng)階段），新產(chǎn)品酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丙酮和丁醇（第一個工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品）第三階段---現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段：通氣攪拌技術階段（深層通氣培養(yǎng)法），技術要求高、發(fā)展速度快；生產(chǎn)規(guī)模大；菌種生產(chǎn)能力大幅提高，新產(chǎn)品、新技術、新設備的應用達到前所未有的程度。1942年青霉素工業(yè)化生產(chǎn)。第四階段---生物技術產(chǎn)業(yè)階段：利用基因工程菌進行發(fā)酵。三、發(fā)酵工程的研究內(nèi)容生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)和選育（菌種）培養(yǎng)基制備和滅菌（培養(yǎng)基）發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制（通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵及條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程參數(shù)控制、反應器的設計）產(chǎn)物的分離、提取與精制等（純化）發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個要素：

生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝、發(fā)酵設備第二節(jié)優(yōu)良菌種的選育一、菌種選育的物質(zhì)基礎：遺傳物質(zhì)（DNA）二、自然選育不經(jīng)過人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程正變菌株：生長良好、生產(chǎn)水平提高、對生產(chǎn)有利的變異個體負變菌株：生產(chǎn)能力下降、形態(tài)出現(xiàn)異性，生產(chǎn)水平下降，菌種退化特點：純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)水平、提高產(chǎn)物產(chǎn)量；但效率低、進展慢，通常將自然選育和誘變育種交替使用三、誘變育種

用人工方法來誘發(fā)突變是加速基因突變的重要手段，突變部位一般是在遺傳物質(zhì)DNA上，因此突變后性狀能穩(wěn)定的遺傳。（一）方法和原理1.誘變機制（1）微小損傷突變：堿基置換、移碼突變（2）染色體畸變：由于遺傳物質(zhì)的缺失或重排造成（易位、倒位、缺失、重復）（3）染色體組突變：指由有絲分裂或減數(shù)分裂異常而產(chǎn)生的染色體數(shù)目或組數(shù)的變化。2.誘變劑及作用方式：誘變劑：能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過自發(fā)突變水平的物理化學因子。（1）物理誘變劑

紫外線、x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。（2）化學誘變劑金屬離子、一般化學試劑、生物堿、抗代謝物、生長刺激素、抗生素、高分子化合物、殺菌劑、染料等。對DNA的作用形式：與一個或多個核酸堿基起化學反應，引起DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而導致變異；如亞硝酸、硫酸二乙酯等與天然堿基相似的類似物摻入到DNA分子上引起的；如5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤等DNA分子上減少或增加一兩個堿基引起堿基突變點以下的全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯的錯誤---移碼突變。如吖啶類物質(zhì)三、誘變育種（二）誘變和篩選誘變---以合適的誘變劑處理細胞懸浮液包括：出發(fā)菌株的選擇---誘變劑種類和誘變劑劑量的選擇---合理的使用方法篩選---用合適的方法淘汰負變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株包括：初篩---重復篩選---突變株性能檢測---直到獲得新的優(yōu)良菌株實用意義較大的初篩方法有以下幾種：自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素；開始合成抗生素的時間提早，產(chǎn)量也有所提高結構類似物或前體類似物的耐受突變株：解除反饋抑制，積累過量產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型突變株及其回復突變株：解除反饋抑制、阻斷分支途徑四、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體：除去細胞壁的細胞，或是被質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。原生質(zhì)體融合：指通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。1.原生質(zhì)體融合的一般程序：溶壁作用：細菌、放線菌（溶菌酶）、真菌（蝸牛酶）、霉菌（蝸牛酶、纖維素酶）原生質(zhì)體在高滲溶液下用PEG作助融劑，將兩種親株原生質(zhì)體進行融合在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑出融合重組子2.影響融合的因素

菌齡：一般采用對數(shù)前期的菌體，原生質(zhì)體形成率較高培養(yǎng)基成分：在限制性培養(yǎng)基上比在于完全培養(yǎng)基上原生質(zhì)體形成效果好，可能是由于完全培養(yǎng)基中的有機成分或某些金屬離子會引起細胞壁成分的改變，導致對溶壁酶敏感性的改變。PEG：相對分子質(zhì)量（4000或6000）、濃度（30~40%）外界因素：高滲溶液配制、再生培養(yǎng)基中加入酵母膏促進再生速度、原生質(zhì)體密度要適當3.原生質(zhì)體融合育種意義：打破了微生物的種界界限，可實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會。去除了細胞壁屏障，融合重組頻率比較高。可與其他育種方法相結合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中。用途：改良菌株，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，打破種屬界限、產(chǎn)生重組子，有可能產(chǎn)生新的化合物。第三節(jié)發(fā)酵的基本過程

菌種---種子制備---發(fā)酵---發(fā)酵液預處理---提取精制

一、菌種對生產(chǎn)菌種的要求：產(chǎn)量高、生長快、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)生產(chǎn)菌種的保存：0~4℃休眠保存，砂土管或冷凍干燥管二、種子的制備使菌種繁殖，獲得足夠數(shù)量的菌體，以便接入發(fā)酵罐中三、發(fā)酵使微生物產(chǎn)生大量的目的產(chǎn)物，是發(fā)酵的關鍵階段。參數(shù)：通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、罐溫、培養(yǎng)基總體積、黏度、泡沫、菌絲形態(tài)、pH、溶氧濃度、排氣中二氧化碳含量等四、產(chǎn)物提取發(fā)酵液的預處理和過濾，提取，精制第四節(jié)發(fā)酵方式一、分批發(fā)酵將全部物料一次投入到反應器中，經(jīng)滅菌、接種、發(fā)酵后再將發(fā)酵液一次放出的操作過程。特點：（1）整個培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其他物質(zhì)交換（O2、CO2、消泡劑、酸堿除外）（2）整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法

分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點：產(chǎn)率低應用廣泛，改善中（在線監(jiān)測，計算機控制）二、連續(xù)發(fā)酵微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時不斷放出代謝物，使微生物在近似恒定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方式。特點：菌濃度、產(chǎn)物濃度、限制性基質(zhì)濃度均處于恒定狀態(tài)。應用在廢水處理、葡萄糖酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵等工業(yè)中連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點優(yōu)點：操作穩(wěn)定，利于機械化、自動化；控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化，發(fā)酵周期長，產(chǎn)量高缺點：長期連續(xù)發(fā)酵會引起菌種退化，降低產(chǎn)量，染菌機會增加，對產(chǎn)品類型的適應性不廣，對設備及附件要求高三、補料分批發(fā)酵將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。應用廣泛，用于氨基酸、抗生素等工業(yè)補料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點優(yōu)點：與分批發(fā)酵相比延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間可避免在分批培養(yǎng)過程中因一次性投糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多的狀況達到高濃度細胞培養(yǎng)稀釋有毒代謝產(chǎn)物優(yōu)點：與連續(xù)發(fā)酵相比因為操作時間有限，降低了染菌，避免了遺傳不穩(wěn)定性最終產(chǎn)物濃度較高，有利于產(chǎn)物的分離使用范圍廣，在生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物和細胞高濃度培養(yǎng)中普遍采用。

缺點：由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導致生產(chǎn)速率的下降由于物料的加入增加了染菌機會第五節(jié)發(fā)酵工藝控制一、培養(yǎng)基的影響及其控制碳源：占菌體干物質(zhì)的50%以上是碳主要功能：提供能源、菌體成分、產(chǎn)物碳架來源：糖類、脂肪、有機酸、碳氫化合物速效碳源：如葡萄糖，能較迅速的參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，有利于菌體的生長，但有的分解代謝產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用；遲效碳源：如淀粉、乳糖、油脂等，被菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，為許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。氮源：占菌體干物質(zhì)的10%主要功能：構成細胞物質(zhì)、構成蛋白質(zhì)等產(chǎn)物的成分來源：無機氮源、有機氮源（速效氮源氨基酸、玉米漿、遲效氮源黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉）速效氮源：如氨基酸、玉米漿等，有利于菌體的生長；遲效氮源：如黃豆餅粉、花生餅粉等，有利于代謝代謝產(chǎn)物的形成無機鹽和微量元素主要功能：構成菌體原生質(zhì)的成分（S、P）、作為酶的組成部分或維持酶的活性（鎂、鐵、鋅、鈣、磷等）、調(diào)節(jié)細胞的滲透壓（NaCl、KCl等）和pH，參與產(chǎn)物的合成水：物質(zhì)溶解和生化反應的基礎功能：機體的重要組成成分、參加一些代謝反應、良好溶劑和熱導體二、溫度的影響及其控制1.影響發(fā)酵溫度變化的因素

（1）生物熱：微生物在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱能；與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間、呼吸強度有關（2）攪拌熱：攪拌器轉(zhuǎn)動引起的液體之間和液體與設備之間摩擦所產(chǎn)生的產(chǎn)生的熱量（3）蒸發(fā)熱：水分蒸發(fā)所需熱能（4）輻射熱：罐內(nèi)外氣溫差使熱能向大氣輻射的熱量2.溫度的選擇與控制（1）最適發(fā)酵溫度的選擇：最適生長溫度、最適生產(chǎn)溫度變溫發(fā)酵，如青霉素發(fā)酵30℃5h---25℃35h---20℃85h---25℃40h---放罐；青霉素產(chǎn)量比25℃恒溫發(fā)酵高14.7%（2）溫度控制一般不需加熱，冷卻水（冷凍鹽水）通過夾層循環(huán)冷卻三、溶氧的影響及其控制1.溶氧的影響最適氧濃度：菌體生長或產(chǎn)物合成最適濃度范圍臨界氧濃度：滿足微生物呼吸的最低氧濃度2.發(fā)酵過程的溶氧變化溶氧異常下降（污染好氣雜菌，菌體代謝異常，設備故障）溶氧異常升高（污染噬菌體，菌體代謝異常）3.溶氧濃度的控制溶氧濃度決定因素：供氧和需氧兩方面。供氧方面：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)通氣速率需氧方面：菌體濃度：耗氧量、氧傳遞速率基質(zhì)種類和濃度培養(yǎng)條件：如溫度、中間補水等四、pH的影響及其控制1.pH對發(fā)酵的影響影響酶的結構和活性影響微生物對基質(zhì)的利用速率和細胞的結構影響微生物細胞膜的電荷狀況影響代謝方向2.pH的變化取決于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件3.發(fā)酵pH的確定和控制（1）發(fā)酵pH的確定：菌種、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、溫度微生物發(fā)酵的最適pH范圍一般在5~8之間，根據(jù)實驗確定，即配制不同初始pH的培養(yǎng)基，考察發(fā)酵情況。（2）發(fā)酵pH的控制常用的控制方法有：調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎配方達到適當配比，使pH變化在合適范圍內(nèi)通過加酸堿：硫酸銨、氨水采用中間補料的方法：如尿素第六節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取一、吸附法利用適當?shù)奈絼ɑ钚蕴?、白陶土、氧化鋁等），在一定的pH條件下，使發(fā)酵液中的抗生素被吸附劑吸附，然后改變pH，以適當?shù)南疵搫ㄒ话闶怯袡C溶劑）把抗生素從吸附劑上解吸下來，以達到濃縮和純化的目的。優(yōu)點：操作簡單，原料易解決，成本低缺點：吸附劑吸附性能不穩(wěn)定，選擇性不高，不能連續(xù)操作，影響環(huán)境衛(wèi)生，所以一般不采用二、沉淀法是指利用某些抗生素具有兩性的性質(zhì)，使其在等電點時從溶液中沉淀出來或在一定pH條件下，能與某些酸、堿或金屬離子形成不溶性或溶解度很小的復鹽，使抗生素從發(fā)酵濾液中沉淀下來，以及改變pH等條件時，此種復鹽又易分解或重新溶解的特性，來提取抗生素的一種方法。優(yōu)點：設備簡單，原料易解決，節(jié)省溶劑，成本低，收率高缺點：過濾較困難，往往和溶劑法結合使用

三、溶劑萃取法利用抗生素在不同的pH條件下以不同的化學狀態(tài)存在，以及它們在水及與水不互溶的溶劑中溶解度的不同的特性，使抗生素從一種液體轉(zhuǎn)移到另一個液體中去，以達到濃縮和提純的目的。優(yōu)點：產(chǎn)品純度高，濃縮倍數(shù)大，能連續(xù)生產(chǎn)，周期短缺點：溶劑耗量大，成本高，設備要求高（溶劑回收，防火防爆）四、離子交換法利用某些抗生素能離解成陽離子或陰離子的特性，使其與離子交換樹脂進行選擇性交換作用，再用洗脫劑從樹脂上將抗生素洗脫下來，以達到濃縮和提純的目的。優(yōu)點：成本低，設備簡單，節(jié)省溶劑，操作方便缺點：周期長，pH變化大，不適于穩(wěn)定性差的抗生素第七節(jié)發(fā)酵設備理想的微生物細胞生物反應器的基本要求生物反應器的材料無毒，穩(wěn)定性好，一般用不銹鋼制成密封良好，避免污染生物反應器的結構：滿足傳質(zhì)、傳熱、混合的性能容器內(nèi)表面光滑，無死角，利于清潔滅菌任何接口處都不能有泄漏攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應適當能自動控制和調(diào)節(jié)多種理化參數(shù)第八節(jié)基因工程在發(fā)酵工程中的應用一、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用（一）提高抗生素產(chǎn)量1.

增加生物合成中限速階段酶系基因的拷貝數(shù)2.

通過調(diào)節(jié)基因的作用：增加正調(diào)節(jié)基因或降低負調(diào)節(jié)基因的作用3.

增加抗性基因：有些抗性基因是和抗生素的生物合成基因連鎖，它們的轉(zhuǎn)錄有可能也是緊密相連的，是激活生物合成基因進行轉(zhuǎn)錄的必需成分。（二）改善抗生素組分應用基因工程方法可以定向的改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。（三）改進抗生素生產(chǎn)工藝利用重組DNA技術，把血紅蛋白基因克隆到生產(chǎn)菌種，提高傳氧速率，解除供氧水平對高產(chǎn)發(fā)酵的限制。（四）產(chǎn)生雜合抗生素雜合抗生素是通過遺傳重組技術產(chǎn)生的新的抗菌活性化合物。1.生物合成途徑中某個酶基因突變：會使中間產(chǎn)物積累，也可能使合成途徑越過變異的酶直接由后續(xù)酶作用進行生物合成，從而產(chǎn)生一系列新的抗生素衍生物。2.在生物合成途徑中引入一個酶基因3.利用底物特