基因工程(GeneEngineering)授課老師：楊帆電話子郵件：yangfan0808@163.com生物工程系考核方法平時成績30%閉卷考試70%填空題20%出勤回答問題每章課程總結名詞解釋20%簡答題30%100%單項選擇10%論述題20%本課程的性質和任務

《基因工程》是在我們生命科學學院各專業(yè)中的一門非常重要的專業(yè)課。它是在微生物、遺傳學和分子生物學等課程的基礎上而開設的。通過這門課程的學習，希望學生掌握基因工程的基本原理和應用設計策略，為今后進一步的研究生學習、科研和工作打下重要的理論基礎。教學目的深入理解分子生物學知識；啟發(fā)科學思維方法；掌握基因工程技術的基本原理和技術；課堂理解消化吸收90%以上；掌握一定的專業(yè)英語詞匯。學習要求掌握基因克隆的基本工具；特別是不同的載體、工具酶?？寺』虻幕痉椒?。利用基因工程生產重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農業(yè)上的應用。能夠設計一個基因克隆、表達的程序。授課計劃第一章緒論（2學時）第二章基因工程的酶學基礎（4學時）第三章基因克隆的載體（4學時）第四章基因工程的主要技術及其原理（6學時）第五章目的基因的獲得（4學時）

第六章大腸桿菌基因工程（4學時）

第一章緒論第一節(jié)基因和基因工程

第二節(jié)基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎第三節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展第四節(jié)基因工程的意義與發(fā)展前景

第一章緒論

生物技術包括四大工程技術基因工程技術、細胞工程技術、蛋白質及酶工程技術、發(fā)酵工程技術基因工程技術是生物技術的核心和關鍵，是主導技術細胞工程技術是生物技術的基礎蛋白質及酶工程技術是生物技術的條件發(fā)酵工程技術是生物技術獲得最終產品的手段生物技術是一個綜合技術體系，其中基因工程和細胞工程技術最為突出。一、基因（gene）1.基因——生命的載體

基因是生物遺傳信息的載體，它是由核苷酸序列(通常為DNA)組成的生物大分子，決定著生物的所有性狀、行為和疾病的發(fā)生。它是遺傳物質的最小功能單位。

基因工程理論依據

不同基因具有相同的物質基礎，所有生物的DNA的基本結構都是相同的?；蚴强梢郧懈畹幕蚴强梢赞D移的多肽與基因之間存在對應關系遺傳密碼是通用的基因通過復制把遺傳信息傳給下代2.基因是福音

發(fā)現(xiàn)了某疾病基因，就可以對患者進行基因水平上的治療，從根本上根除疾病的危害。

3.基因是企業(yè)家的聚寶盆巨大的市場：基因工程藥物潛在的市場：肥胖基因（2000萬美元）4.基因是鐵的證據

基因分析在重大犯罪案件、歷史案件的偵破中是最終確定罪犯的有力工具，當事人的頭發(fā)、血、皮屑的基因分析都將作為確鑿證據。

二、基因工程概念

基因工程(geneengineering):就是對不同生物的遺傳物質，在體外進行剪切、組合和拼接，使遺傳物質重新組合，然后通過載體轉入微生物、植物和動物細胞內，進行無性繁殖（繞過有性生殖），并使所需要的基因在細胞中表達，產生出人類所需要的產物或組建成新的生物類型。又名遺傳工程（GeneticEngineering)DNA重組技術(RecombinantDNATechniques)分子克?。∕olecularCloning)基因工程最突出的優(yōu)點

就是打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間界限，可使原核生物與真核生物之間、動物與植物之間、甚至人與其他生物之間的遺傳信息進行重組和轉移。

縮短了新物種出現(xiàn)的時間。基因工程的基本操作程序

生物材料人工合成cDNA文庫mRNA目的基因基因組文庫DNA克隆載體酶切+重組DNA受體細胞導入克隆子篩選轉基因生物基因工程技術路線1、DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）2、DNA片段和載體的連接——重組體DNA3、外源DNA片段引入受體細胞——基因克隆和基因文庫4、選擇基因（目的基因）5、目的基因表達切接轉選表達基因工程技術路線基因工程四大要素：

供體基因

載體

工具酶

受體細胞

（細菌、植物和動物）基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎一、基因工程誕生的理論基礎（一）理論上的三大發(fā)現(xiàn)

1.DNA是生物的遺傳物質（基因工程的先導）

1944年，美國微生物學家O.T.Avery首次證實遺傳物質的基礎是DNA，基因位于DNA上。肺炎雙球菌轉化實驗

S型肺炎球菌

R型肺炎球菌加熱殺死混合老鼠死老鼠活老鼠活老鼠死

S型肺炎球菌

R型肺炎球菌40年代，DNA是遺傳物質被證實1944年，美國洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公開發(fā)表了改進的肺炎雙球菌實驗結果。

（1）S型菌無細胞提取物及其純化的DNA都可使R型菌轉變成S型菌；（2）經DNase

處理的S型菌無細胞提取物失去了轉化作用。（3）經胰蛋白酶處理的S型菌無細胞提取物仍有轉化作用。不僅證實了DNA是遺傳物質，而且證明了DNA可以將一個細菌的性狀轉給另一個細菌，他的工作被稱為是現(xiàn)代生物科學的革命性開端?；蚬こ痰陌l(fā)展歷程和理論基礎2.揭示了DNA分子的雙螺旋結構和半保留復制機制

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結構和半保留復制機制?；蚬こ痰陌l(fā)展歷程和理論基礎1966年Nireberg等破譯了全部64個遺傳密碼3.遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎DNAmRNAProteintranscriptiontranslation

1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”(centraldogma)，揭示了遺傳信息的流向和表達問題。基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎一、基因工程誕生的理論基礎

（二）技術上的三大發(fā)明1.限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA切割

1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內切酶HindII。1972年Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了ＥcoRI一類重要的限制性內切酶。WernerArber理論預見限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學獎基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎2.DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接

1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNA連接酶；

1970年Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶。

3.基因工程載體的研究與應用

1972年前后使用小分子量的細菌質粒和噬菌體作載體。在細菌細胞里的大量擴增。理論上的三大發(fā)現(xiàn)：證明了生物的遺傳物質是DNA（基因工程的先導）——

明確了遺傳的物質基礎問題DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理——

解決了基因的自我復制和傳遞的問題遺傳信息的傳遞方式（“中心法則”和“操縱子學說”，成功破譯遺傳密碼）——

闡明了遺傳信息的流向和表達問題技術上的三大發(fā)現(xiàn)：限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)（標志著DNA重組時代的開始）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)載體的使用基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎

基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎二、基因工程的誕生

(一）Berg的開創(chuàng)性實驗

1972年美國斯坦福大學Berg博士領導的研究組用EcoRI在體外對猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體DNA分別酶切，然后用T4DNA連接酶將兩種酶切片段連接，結果獲得了SV40和λ噬菌體DNA的重組DNA分子，成功完成了世界上第一次DNA體外重組實驗，并因此與Gilbert、Sanger分享1980年度諾貝爾化學獎?；蚬こ痰陌l(fā)展歷程和理論基礎EcoRIrecognitionsites

λphageDNAEcoRIcutsDNAintofragments

StickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairing

DNAligaseRecombinantDNA1972年第一個DNA重組分子產生基因工程的發(fā)展歷程和理論基礎

(二）Boyer-Cohen實驗

1973年，Cohen等人將編碼Kan抗性基因質粒R6-5和編碼Tet抗性基因質粒pSC101混合后，加入EcoRI進行酶切，用T4DNA連接酶連接成重組DNA分子，最后轉化大腸桿菌，結果某些轉化菌落表現(xiàn)出既抗Kan又抗Tet的雙重抗性特性。從這種雙抗性轉化菌落的大腸桿菌中分離出的重組質粒DNA帶有完整pSC101分子和一個來自R6-5質粒編碼Kan抗性基因DNA片段。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質粒重組，轉化大腸桿菌，并在菌體內成功轉錄出相應的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗。Cohen等的重組實驗示意圖pSC101R6-5TcrNerEcoRIEcoRI連接酶TcrNer雙抗重組菌落基因工程發(fā)展史上首次實現(xiàn)了重組DNA的細菌轉化基因工程的誕生與發(fā)展三、基因工程的發(fā)展

(一）艱難階段

主要關注安全性問題

(二）逐漸成熟階段

1977年第一次實現(xiàn)基因在原核生物中的表達

(三）迅速發(fā)展階段

20世紀80年代以后，高等動植物的遺傳轉化?；蚬こ痰恼Q生與發(fā)展發(fā)展過程中的重大事件：1977年，E.coli中合成了人生長激素基因。1978-1979年，胰島素基因在大腸桿菌中表達。1982年，培育出了超級鼠。1985年，Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：

葉圓盤法，并獲得轉基因植株。1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak將B.T.基因導入棉花獲得抗蟲棉。1991年，美國開始人類基因組計劃。1997年，“多利”綿羊誕生。基因工程研究的主要內容一、基因工程研究的主要內容

（一）基礎研究構建克隆載體及相應的表達系統(tǒng)、基因不同物種的基因組文庫和cDNA文庫、開發(fā)新的工具酶、基因工程新技術、新的操作方法?；蚬こ萄芯康闹饕獌热荩ǘ┛寺≥d體研究基因工程的發(fā)展是與克隆載體構建密切相關的；

Ti質粒的發(fā)現(xiàn)使植物基因工程研究迅速發(fā)展起來；動物病毒克隆載體的構建，使動物基因工程研究也有一定的進展?？梢哉J為構建克隆載體是基因工程技術路線中的核心環(huán)節(jié)。構建適合于高等動植物轉基因的表達載體和定位整合載體是今后研究的重要內容。基因工程研究的主要內容（三）受體系統(tǒng)的研究

基因工程的受體細胞與載體是一個系統(tǒng)的兩個方面。受體是克隆載體的宿主，是外源目的基因復制和表達的場所。受體：單細胞、組織、器官和個體均可以作為受體。原核生物受體：E.coli真核生物受體:酵母是單細胞真核生物受體植物受體：愈傷組織、細胞和原生質，部分組織和器官；動物受體：生殖細胞和早期胚胎細胞作為基因工程受體；人的體細胞也可以作為基因工程受體?；蚬こ萄芯康闹饕獌热荩ㄋ模┠康幕蜓芯?/p>

基因工程研究的基本任務：開發(fā)人民需要的基因產物，這樣的基因叫做目的基因。

獲得目的基因的方法：主要通過構建基因組文庫或cDNA文庫，從中篩選出特殊需要的基因?；颍横t(yī)藥相關的基因；抗病、蟲害和惡劣環(huán)境的基因；特殊營養(yǎng)價值的蛋白或多肽的基因。

基因工程研究的主要內容（五）生物基因組學研究

嗜血流感桿菌：1830137bp，1743個基因產甲烷球菌：1664976bp，1682個基因大腸桿菌K-12：4639221bp，4288個基因枯草桿菌：4.21×106bp,4100個基因

1980年提出HumanGenomeProject(HGP)；

1990年開始，美國、英國、日本、德國、法國等國實施“人類基因組計劃”；我國1999年9月獲準參加這一計劃，承擔1%的測序任務。

2000年6月，人類基因組工作草圖繪制成功?；蚬こ萄芯康闹饕獌热荩醚芯抗w細胞

目的基因

載體

重組DNA分子

轉化細胞

受體細胞

多肽藥物

疫苗、抗體

基因治療

基因診斷

轉基因動物

(畜牧業(yè)、漁業(yè)

生物反應器)

轉基因植物

(農業(yè)、林業(yè)

生物反應器)

冶金、環(huán)保

輕工、食品

基因工程研究的主要內容●光合作用●固氮作用●轉基因植物●轉基因動物●產生次生代謝產物

（六）應用研究

1.基因工程與農業(yè)抗病蟲提高品質提高花卉的觀賞價值抗逆性基因工程研究的主要內容無冰晶細菌幫助草莓抗霜凍基因工程研究的主要內容基因工程研究的主要內容轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉魚抗寒基因的番茄轉黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯不會引起過敏的轉基因大豆基因工程研究的主要內容生長快、耐不良環(huán)境、肉質好的轉基因魚(中國)基因工程研究的主要內容乳汁中含有人生長激素的轉基因牛(阿根廷)動物器官反應器：血液反應器和乳腺反應器基因工程研究的主要內容基因工程研究的主要內容導入貯藏蛋白基因的超級羊和超級小鼠導入人基因具特殊用途的豬和小鼠基因工程研究的主要內容

就基因藥物而言，最理想的表達場所是

轉基因動物的乳腺。

1）乳腺是一個外分泌器官，乳汁不進入體內循環(huán)，不會影響轉基因動物本身的生理代謝反應。

2）從乳汁中獲取目的基因產物，產量高，易提純，表達的蛋白質已經過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。

3）從乳汁中源源不斷獲得目的基因的產物的同時，轉基因動物又可無限繁殖?；蚬こ萄芯康闹饕獌热荨窭w維素的開發(fā)利用●釀酒工業(yè)●食品工業(yè)●制藥工業(yè)●新型蛋白質的生產（六）應用研究

2.基因工程與工業(yè)基因工程研究的主要內容胰島素100kg胰腺→4-5g胰島素2000L培養(yǎng)液→

100g胰島素！基因工程研究的主要內容

基因工程藥品——生長激素治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，使其生產生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產量?；蚬こ萄芯康闹饕獌热?/p>

干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍貴”程度自不用多說。

人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現(xiàn)工業(yè)化生產，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。人造血液及其生產基因工程藥品——干擾素主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間產品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國基因工程研究的主要內容（六）應用研究

3.基因工程與環(huán)境保護●環(huán)境監(jiān)測●環(huán)境污染凈化

4.基因工程與醫(yī)學

●基因工程疫苗的研制與生產●基因診斷●基因治療

基因工程研究的主要內容

基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。

1t水中只有10個病毒也能被DNA探針檢測出來基因工程研究的主要內容

利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。基因工程研究的主要內容

基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質。

通常一種細菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質。基因工程研究的主要內容基因工程研究的主要內容基因診斷

基因診斷：利用重組DNA技術作為工具，直接從DNA水平監(jiān)測人類遺傳性疾病的基因缺陷，因而比傳統(tǒng)的診斷手段更加可靠。

基因探針技術：利用DNA堿基互補的原理，用已知的帶有標記的DNA通過核酸雜交的方法檢測未知的基因?；蚬こ萄芯康闹饕獌热莼蛑委煟╣enetherapy）基因治療：將外源正?；驅氚屑毎〈蛔兓?，補充缺失基因或關閉異?；?，達到從根本上治療疾病的目的?；蛑委熓?1世紀的一大熱點領域；被認為是征服腫瘤、心血管疾病、糖尿病尤其是遺傳性疾病最有希望的手段。

通過研究“基因敲除”的耗子將幫助研究人類的癌癥、糖尿病和高血壓等慢性疾病與遺傳的關系。

在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活潑的小猴“安迪”。

通過對“安迪”的研究我們可以簡單地引進如老年性癡呆病的基因、帕金森病基因等，加快針對這類疾病疫苗的開發(fā)研究。

基因工程研究的主要內容（七）基因工程在其他方面的應用

目前，基因工程在其他方面的應用也取得了令人振奮的成果。如日本科學家利用基因工程使家蠶絲心蛋白基因與綠色熒光蛋白基因相互融合，得到的家蠶蠶絲可發(fā)出綠色的光澤。人們利用花卉的花色基因改變花的顏色、利用花形基因改變花的形狀、利用香味基因改變花的香味等等，以使我們的生活環(huán)境更加色彩斑斕?；蚬こ痰囊饬x與發(fā)展前景一、基因工程的意義●基因工程跨越生物種屬間不可逾越鴻溝●基因工程技術縮短了進化時間●基因工程技術使人能對生物進行定向改造●基因工程技術可以在體外大量擴增、純化人們感興趣的基因，研究其結構、功能及調控機制，從而拓寬了分子生物學的研究領域?；蚬こ痰囊饬x與發(fā)展前景二、基因工程發(fā)展前景(一)基因本身也是一個產業(yè)

1.Rockfeller大學將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）

2.Amgen公司將FKBP神經免疫因子配體轉讓達3.29億美元（1997年）

3.Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉讓225種基因的開發(fā)權（1998年9月）基因工程的意義與發(fā)展前景(二)基因工程試劑的高回報

1.堿性成纖維細胞生長因子231元/ug2.紅細胞生成素1072元/ug3.白細胞介素-2410元/ug4.巨細胞粒細胞集落刺激因子1960元/ug5.胰島素10.2元/mg基因工程的意義與發(fā)展前景基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。本章重點掌握的內容及作業(yè)題本章重點掌握的內容◆基因工程的概念及基本技術路線◆了解基因工程的發(fā)展簡史及其意義作業(yè)題◆預習第二章“基因工程的酶學基礎”并寫出每章內容的課程總結（處緒論外）。不同基因具有相同的物質基礎

在原則上，所有生物的DNA都是可以重組互換的，因為地球上的一切生物，無論是高等還是低等，他們的基因都是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片斷，而所有生物的DNA結構都是一樣的。有些病毒的基因定位在RNA上，但這些病毒RNA可以通過反轉錄產生cDNA，并不